Metody badan strukturalnych w biotechnologii

1
Metody badan strukturalnych w biotechnologii

• Wyklad VI
• Spektroskopia NMR techniki dwuwymiarowe

2
Widmo 1H NMR aktyny bialka zbudowanego z 375
reszt aminokwasowych
3

• W przypadku wiekszych ukladów i makromolekul
  widma jednowymiarowe nie dostarczaja
  dostatecznych informacji konieczne staje sie
  zastosowanie technik dwuwymiarowych. Generalnie
  widma tego typu bazuja na dwóch typach
  oddzialywan
• - sprzezenie skalarne przez wiazanie badanie
  struktury,
• - sprzezenie dipolowe przez przestrzen
  badania konformacyjne.

4
Wielowymiarowy NMR
2D
3D
1D
MW 10000
MW 30000
MW 300
5
(No Transcript)
6
Schemat eksperymentu jednowymiarowego
7
Eksperyment dwuwymiarowy
8
W rezultacie otrzymujemy
9
(No Transcript)
10
Najpopularniejsze eksperymenty dwuwymiarowe
Eksperyment Rodzaj badanych oddzialywan zastosowanie
COSY COrrelated SpectroscoPY Homojadrowe sprzezenie spin-spin Analiza sprzezonych ze soba atomów
DQF COSY Double Quantum Filtered COSY Homojadrowe sprzezenie spin-spin Analiza sprzezonych ze soba atomów, Pomiar stalych sprzezenia
TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY Homojadrowe sprzezenie spin-spin Korelowanie ze soba calych ukladów spinowych
11
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum coherence Heterojadrowe sprzezenia spin-spin Korelacja przesuniec chemicznych protonów i heteroatomòw zwiazanych przez jedno wiazanie
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heterojadrowe sprzezenia spin-spin Korelacja przesuniec chemicznych protonów i heteroatomòw zwiazanych przez kilka wiazan
COSY-LR Longrange Correlated SpectroscopY Heterojadrowe sprzezenia spin-spin Analiza sprzezen dalekiego zasiegu
12
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY Homojadrowe oddzialywania dipolowe Wyznaczanie odleglosci pomiedzy atomami
ROESY Rotating Frame NOESY Homojadrowe oddzialywania dipolowe Wyznaczanie odleglosci pomiedzy atomami, stosowane w badaniach makromolekul
13

• W badaniach strukturalnych najwieksze znaczenie
  maja eksperymenty bazujace na sprzezeniach
  skalarnych poprzez wiazania.
• Na podstawie analizy otrzymanych w ten sposób
  rezultatów mozliwe jest przypisanie sygnalòw na
  widmie a co za tym idzie okreslenie struktury.
• A oto kilka przykladów

14
(No Transcript)
15
(No Transcript)
16
Widmo HHCOSY ß-butyrolaktonu
17
Widmo HHCOSY kodeiny
H-5 gt H-3 gt H-10 gt OHH-10 -gt H-9H-3 gt
H-16H-16 gt H-11
18
Spektroskopia 13 C NMR

• Metoda ta rozwinela sie stosunkowo niedawno
  podstawowe przeszkody we wczesniejszym
  wykorzystaniu tej techniki stanowily
• - natruralna abundancja izotopu 13C wynosi
  zaledwie 1.1,
• - czterokrotnie mniejsze odstepy poziomów
  spinowych (w porównaniu do 1H), co w rezultacie
  daje znacznie mniejsza intensywnosc sygnalów

19

• Pelne wykorzystanie faktu zjawiska weglowego
  rezonansu jadrowego umozliwily
• - ulepszenie metodyki i aparatury wprowadzenie
  rejestracji widm metoda impulsowa z transformacja
  Fouriera,
• - wykonywanie widm z rozprzeganiem jader 13C -
  brak multipletowosci na widmie powoduje
  zwiekszenie intensywnosci sygnalów.
• W przypadku spektroskopii podstawowym kryterium
  analizy widm jest przesuniecie chemiczne.

20
Zakresy przesuniec chemicznych na widmach 13C NMR
21
Widmo 1H i 13C NMR ß-butyrolaktonu
22
Widmo CHCOSY ß-butyrolaktonu
23
Widmo HHCOSY i CHCOSY 1-butanolu
24
Widmo CHCOSY modyfikowanego glutationu
25
(No Transcript)
26
Widmo HH COSY
27
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

• Korelacja przesuniec chemicznych protonów
  zwiazanych z jadrem X przez jedno wiazanie

28
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

• Korelacja przesuniec chemicznych protonów
  zwiazanych z X przez kilka wiazan

29
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
30
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
31
Widmo HHCOSY i TOCSY reszty aminokwasowej
32
2002 nagroda Nobla z dziedziny chemii -Kurt
Wüthrich pokazal, ze strukture bialek mozna
badac za pomoca NMR
33
Widmo NMR bialka
34
NOESY
TOCSY
35
Widmo NOESY bialka
36
(No Transcript)
37
Oddzialywania obserwowane na widmie NOESY
38
Spektroskopia NMR
Przypisanie sygnalów Intensywnosc Sygnalów
NOE Sprzezenia
obliczenia dynamiki molekularnej
39
(No Transcript)