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Como a Rea

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Como a Rea o em Cadeia da Polimerase (PCR), PCR em tempo real e o Sequenciamento de genes s o ferramentas importantes na investiga o cient fica e no ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: Como a Rea


1
Como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), PCR
em tempo real e o Sequenciamento de genes são
ferramentas importantes na investigação
científica e no diagnóstico laboratorial ?
Viveca Giongo Laboratório de Virologia
Molecular, Departamento de Biologia Celular e
Molecular/UFF
2
Comparação dos valores de sensibilidade entre os
ensaios imunológicos
3
Parâmetros para validação de um teste sorológico
  • Sensibilidade - refere-se à porcentagem de
    resultados positivos pelo teste na população
    doente. Verdadeiros Positivos
  • Sensibilidade VP/VPFN
  • Especificidade - porcentagem de resultados
    negativos pelo teste em indivíduos não doentes.
    Proporção dos verdadeiros negativos
  • Especificidade VN/ VNFP

4
A Sorologia sempre funciona ?
  • Alguns cuidados IgM representa infecção recente.
    Certo?
  • Ela pode permanecer na fase de convalescença
  • Não indica portanto infecção recente
  • Infecções fulminantes por vírus, infecções com
    risco de evolução maligna necessitam de um
    diagnostico precoce

5
Biologia Molecular
6
Reação em Cadeia da Polimerase
7
Histórico...
Nobel Prize, 1968 Principio da replicação do
DNA
Molecular Structure of Nucleic Acids A Structure
for Deoxyribose Nucleic Acid J. D. WATSON F.
H. C. CRICK Medical Research Council Unit for
the Study of the Molecular Structure of
Biological Systems, Cavendish Laboratory,
Cambridge. April 2 Nature 171, 737-738 (25 April
1953) doi10.1038/171737a
8
(No Transcript)
9
Thermus acquaticus
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297
Vol. 98, No. I Thermus aquaticus gen. n. and sp.
n., a Nonsporulating Extreme Thermophile THOMAS
D. BROCK AND HUDSON FREEZE Department of
Microbiology, Indiana University, Bloomington,
Indiana 47401 The isolation of a new
thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n.
And sp. n., is described. Successful enrichment
requires incubation at 70 to 75 C, and the use of
nutrient media relatively dilute with respect to
the organic components. Strains of T. aquaticus
have been isolated from a variety of thermal
springs in Yellowstone National Park and from a
thermal spring in California. The organism has
also been isolated from man-made thermal
habitats, such as hot tap water, in geographical
locations quite distant from thermal springs.
Isolates of T. Aquaticus are gram-negative
nonsporulating nonmotile rods which frequently
form long filaments at supraoptimal temperatures
or in the stationary phase. The optimum
temperature for growth is 70 C, the maximum 79 C,
and the minimum about 40 C. The generation time
at the optimum is about 50 min.
10
Quem inventou a PCR
Kary Mullis, geneticista Nobel Prize em
Química (1993) pelo desenvolvimento de um método
que permite sintetizar, em poucas horas e in
vitro, uma grande quantidade de um determinado
fragmento de DNA Seus estudos em 1985 permitiram
amplificar o DNA
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.,
Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic
amplification of beta-globin genomic sequences
and restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia. Science 230 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific
synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods
Enzymol 155 335-35
11
Quais foram as limitações?
  • Síntese de oligonucleotideos (primers)
  • Purificação de DNA polimerase

12
"for contributions to the developments of methods
within DNA-based chemistry for his invention of
the polymerase chain reaction (PCR) method"
13
PCR
  • Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da
    polimerase)
  • Reação enzimática de polimerização de DNA in
    vitro
  • É uma reação cíclica na qual os produtos de um
    ciclo são substratos para o ciclo seguinte
  • Amplificação de sequências específicas de DNA,
    permitindo sua visualização e/ou análise
    posterior
  • É um processo termodinâmico e enzimático

14
Reação para amplificação de segmento específico
de DNA
  • Exon especifico de um gene humano

15
Cópia molecular
Capaz de copiar e multiplicar parte de uma
sentença
TACGCCGATCTCGTCCGACGCTAGTAACCGATCGGAAGGCCTAAGCATTT
CGCGATGACCTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGC
TACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGG
ATCACTGAGTACAGTACTAGACTACGTAGCTAGACTAGATGCATAGCTAG
CAGTACTTGCATGACTGACTACGTAGCTAGCCGTTAGCTAACGTAGGTTA
CGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGAAGCGT
AGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAAC
CACTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTAC
GTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTG
AGTACTGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCAA
CTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGGCATATTAGTGCGTAGCTAGC
16
Quais são as aplicações da PCR?
  • Diagnósticos moleculares
  • Identificação e isolamento de genes
  • Marcadores moleculares
  • Expressão gênica
  • PCR em tempo real

17
Diagnóstico molecular gripe aviária
18
Diagnóstico molecular meningite e penuemonia
bacteriana
19
HIV
20
Aplicações
  • Teste de Identificação de indivíduos
  • polimorfismo

21
Aplicações expressão gênica e polimorfismo
Polimorfismo p53
MELANOMAS DE MUCOSA ORAL E CUTÂNEOS
22
Elementos da PCR
DNA amostra, DNA polimerase, Termociclador
substitui a helicase e DNTP nucleotideos
trifosfatados
23
Componentes da Reação DNA (DNAg, DNAc Taq
polimerase Primers Tampão MgCl2 dNTPs
24
Qual a importância de oligos Ou primers bem
desenhados?
  • Pré requisito para obter sucesso no PCR
  • alta eficiência
  • maior sensibilidade
  • produtos de PCR especificos
  • ausência de co-amplificação com DNA genômico

25
Avaliação prévia da sequência alvo
  • Observar
  • significado biológico (mRNA/cDNA x gDNA)
  • sequência única
  • qualidade da sequência alvo
  • evitar regiões não desejadas na sequência alvo

26
(No Transcript)
27
Etapas da PCR
1. Desnaturação 2. Anelamento 3. Extensão
28
Principio da PCR
29
(No Transcript)
30
Termocicladores
31
Amplificação Exponencial
32
Ao sair do termociclador a aparência é a mesma
revelação da região amplificada
http//teach.genetics.utah.edu/
33
Quantificação do DNA amplificado
Nanodrop (espectofotômetro) ? 260 nm
34
Trabalhando com PCR convencional
  • 1. Etapas Pré- PCR
  • Coleta da Amostra
  • Estabilização
  • Extração do Ácido Nucleico
  • 2. PCR ou Ciclagem
  • Preparo da Reação
  • Termociclagem
  • 3. Pós-PCR
  • Análise em Gel

35
Tipos de PCR
  • Hot Start
  • In situ
  • Inverse
  • Long
  • Multiplex
  • Nested
  • Competitive
  • Touchdown
  • Degenerate
  • Fast

36
Hot Start PCR
  • A enzima DNA polimerase pode demonstrar uma
    pequena atividade à temperatura ambiente, durante
    a montagem do experimento
  • E isso pode catalisar a extensão da extremidade
    3
  • Levando depois a degradação da extremidade 5pois
    a DNA pol possui atividade exonuclease
  • Destruindo o primer e o substrato
  • Hot Start permite a inibição da atividade da
    polimerase durante o preparo da reação
  • A polimerase esta ligada a anticorpos e não
    funciona a temperatura ambiente
  • O aumento da temperatura libera os ac monoclonais
    e a reação se inicia

37
In situ PCR (ISH)
  • Reação de PCR que ocorre dentro da célula numa
    lâmina
  • Pode ser realizado em células ou tecidos fixados
  • Útil para acompanhar infecções

38
Inverse PCR (IPCR)c
  • DNA cortado em pequenos fragmentos por enzimas de
    restrição
  • Ligação do produto DNA circular
  • DNA novamente tratado com enzimas de restrição
    gera produtos com sequencia interna conhecida,
    que pode ser usada na PCR
  • PCR é realizada com primers complementares às
    sequências internas conhecidas

39
Long PCR
  • PCR cuja extensão é mais longa que as PCR
    convencionais (gt 5Kb)
  • Enzima amplifica alvos maiores (alta fidelidade!)
  • Objetivos
  • - Clonagem de cDNA de longos transcritos
  • - Mapeamento de sequências
  • - PCR de genoma mitocondrial

40
Multiplex PCR
  • PCR com dois ou mais conjuntos de primers, para
    amplificação de diferentes fragmentos de uma
    mesma amostra
  • Objetivos
  • - identificação de vários vírus
  • - identificação de deleções em genes em doenças
    degenerativas (Distrofia muscular de Duchenne)

41
Nested PCR
  • É uma variação da PCR convencional, na qual são
    utilizados dois paraes de primers (ao i nvés de
    um) para amplificar um mesmo fragmento
  • Duas PCR primeira com a fita parental, em
    seguida em uma segunda PCR com a fita menor
  • Aumenta a especificidade!

42
Competitive PCR
  • É adicionada a reação uma quantidade conhecida de
    um fragmento de DNA (competidor)
  • Esse competidor deve conter sequências para os
    mesmos primers utilizados para amplificar o alvo
  • Quantidade de Dna alvo pode ser derterminada pela
    razão Alvo (T) / competidor (C)

43
Touchdown PCR
  • Modificação da PCR convencional que pode resultar
    na diminuição de amplificações não especificas
  • Temperatura de anelamento
  • - começa mais alta que e temperatura ótima dos
    primers
  • - diminuição de 1C a cada um ou dois ciclos, até
    atingir a temperatura específica
  • - após atingir essa temperatura ela é mantida
    nos ciclos restantes
  • Objetivo
  • Aumentar a especificidade, evita amplificação
    errônea
  • 95C 30s
  • 95C 30s, 60C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
  • 95C 30s, 56 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
  • 95C 30s, 53 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
  • 95C 30s, 50 C 30 s, 72 C 1min (25 ciclos)
  • 72C 5 min

44
Degenerate PCR
  • O que são primers degenerados?
  • Primers que possuem um numero de opções em várias
    posições na sequência
  • Exemplo
  • 5- TCGAATTCVCCYAAYTGRCCNT-3
  • ACG V
  • CT Y
  • ACGT N
  • Objetivo avaliar polimorfismo

45
Fast PCR
  • Kits específicos (ex. GeneAmp Fast PCR Master
    Mix)
  • PCR pode ser realizado de forma mais rápida, para
    algumas aplicações, tais como
  • - genotipagem de animais transgênicos
  • - PCR de colônia

46
Limitações da PCR convencional
  • Intensa padronização
  • Baixa sensibilidade e resolução
  • Curta extensão dinâmica (lt 2 logs)
  • Colorações não quantitativas
  • Contaminação (brometo)
  • Discriminação baseada soemnte no tamanho do
    amplicon
  • Não automatizado
  • Necessidade de pós processamento do produto da
    PCR

47
(No Transcript)
48
Real-time PCR with the SYBR Green I dye.
O corante torna-se fluorescente (diamantes
verdes) quando se liga a dupla fita de DNA
49
Real-time PCR with TaqMan primers
O corante torna-se fluorescente (diamantes
verdes) quando se liga a dupla fita de DNA
50
HR-1TM Melt Curve
A única curva isolada ilustra um declínio mais
rápido da fluorescência,indicando uma mutação que
pode ter interrompido o pareamento de bases de
nucleotídeos do DNA
51
Sequenciamento de genes um único primer
52
Sequenciamento de genes - elucidação de genoma
http//www.ncbi.nlm.nih.gov
53
http//www.youtube.com/watch?vgNNI19l1LW8feature
player_detailpage
Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço
da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da
Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química
pelo desenvolvimento de um método que permite
sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma
grande quantidade de um determinado fragmento de
DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna
biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme
progresso a áreas como o diagnóstico de doenças,
medicina forense entre muitas outras para além da
Investigação em Biologia.
Kary Mullins ganhou o prêmio Nobel de química em
1993 por desenvolver o famoso PCR, Reação em
Cadeia da Polimerase, que é um processo usado
muito em labs de biologia molecular para
multiplicar uma pequena quantidade de DNA em
muito DNA, facilitando nosso trabalh
http//www.youtube.com/watch?vgNNI19l1LW8feature
player_detailpage
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