HROMATOGRAFIJA

1
Metode razdvajanja
HROMATOGRAFIJA
Hromatografija (od grc. ???µa - chroma, boja i
??afe?? - grafein pisati) je opšti naziv za grupu
laboratorijskih tehnika za razdvajanje i
izdvajanje komponenata iz razlicitih smeša.
Kretanjem ispitivane smeše, rastvorene u
"mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu
delovi smeše se razdvajaju i izoluju.
- analiticka - preparativna
2
HROMATOGRAFIJA
Metode razdvajanja
Razlicita raspodela komponenata uzorka izmedu dve
faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna),
a druga pokretna (mobilna) u odnosu na prvu.
Eluacija
3
HROMATOGRAFIJA
Pojmovi u hromatografiji
Analit je supstanca koja se razdvaja u
hromatografiji. Analiticka hromatografija se
koristi za odredivanje prisustva i koncentracije
analita u uzorku (smeši).
Preparativna hromatografija služi za
precišcavanje supstanci za odredene svrhe (ne za
analizu).
Hromatogram je vizualni prikaz rezultata
hromatografskog postupka. Svakoj supstanci
odgovara odredeni pik na hromatogramu.

Eluent je komponenta separacijskog sistema koja
pokrece uzorak kroz kolonu. Efluent je
kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone
4
HROMATOGRAFIJA
Pojmovi u hromatografiji
Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u
koloni (GC i LC) ili ploci (npr. silikagel u
TLC), na cijoj se površini odredeno vreme
zadržavaju supstance koje se razdvajaju.
Mobilna faza je faza koja se krece u odredenom
pravcu. Može biti tecna (LC) ili gasovita (GC).
Mobilna faza se krece kroz kolonu noseci uzorak
koji se razdvaja.
Retenciono vreme je vreme za koje analit prode
kroz hromatografski sistem u odredenim uslovima.
Hromatograf je instrument za hromatografiju.

5
HROMATOGRAFIJA
Hromatogram

6
Hromatogrami
7
HROMATOGRAFIJA
Klasifikacija hromatografskih metoda
Razliciti kriterijumi - fizicko-hemijski
fenomeni koji se dešavaju prilikom razdvajanja
(mehanizmi razdvajanja) - fizicko stanje faza
- tehnike
Priroda molekula koji se hromatografski
razdvajaju odreduje tip (vrstu) cvrstog matriksa
(faze) koji ce se koristiti.
8
Opšti pregled najcešcih retencionih mehanizama
koji se primenjuju u razlicitim vidovima
hromatografije.
PODEONA HROMATOGRAFIJA
ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA
JONOIZMENJIVACKA HROMATOGRAFIJA
EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA
AFINITETNA HROMATOGRAFIJA
9
Klasifikacija hromatografskih metoda
Adsorpciona Fenomen adsorpcije
Podeona Fenomen raspodele izmedu dve faze
Na izmenjivacima jona Fenomen izmene jona
Na molekulskim sitima Fenomen molekulskog sita
Afinitetna Fenomen visokospecificnog afiniteta
Kolonske tehnike Laminarne tehnike
10
Klasifikacija hromatografskih metoda
Kolonske tehnike - tecna kolonska
hromatografija - visokopritisna tecna
hromatografija (HPLC - High-performance liquid
chromatography ) - gasna hromatografija

• Laminarne tehnike
• hromatografija na tankom sloju
• (TLC- Thin layer chromatography)
• - papirna hromatografija

11
Klasifikacija hromatografskih metoda
Tecna hromatografija Adsorpciona
(tecno/cvrsto), npr. TLC i HPLC Jonoizmenjivacka
(Jonska) Podeona (Particiona) (tecno/tecno)
Gasna hromatografija Gas/tecno Gas/cvrsto
12
Adsorpciona hromatografija
Mobilna faza koja može biti tecnost ili gas se
prenosi duž cvrste faze (adsorbensa). Ravnoteža
izmedu mobilne i stacionarne faze definiše
separaciju razlicitih supstanci iz smeše.
Separacija razlicitih molekula zavisi od serije
pojava adsorpcija / desorpcija
Cestice iz mobilne faze adsorbovane na površini
adsorbensa (adsorbat)
Koncentracija supstance u stacionarnoj fazi

Cvrsta faza (adsorbens)
Adsorpciona izoterma
Koncentracija supstance u mobilnoj fazi
13
Adsorpciona hromatografija
Adsorbensi koji se koriste u adsorpcionoj
hromatografiji
Slabi Srednje jaki Jaki
Saharoza Skrob Inulin Talk Natrijum karbonat Kalcijum karbonat Kalcijum fosfat Magnezijum karbonat Magnezijum oksid Kalcijum hidroksid Magnezijum silikat Aluminijum oksid Silika-gel Aktivni ugalj
Jacina adsorpcije ? granulacija (površina
adsorbensa), aktivacija, saturacija (H2O)
Adsorpcija nepolarnih molekula raste sa porastom
njihove velicine (mol. mase) Adsorpcija polarnih
molekula raste sa polarnošcu grupa.
Rastvarac ? razvijanje hromatograma ? eluaciona
sposobnost (zavisi od polarnosti, odnosno
dielektricne konstante)
14
Metode za razvijanje (i analizu) hromatograma
Frontalna metoda analize
Metoda istiskivanja
Eluaciona metoda analize
15
Podeona hromatografija
Razdvajanje se vrši izmedu mobilne faze koja može
biti tecna (rastvarac) ili gasovita (gas-nosac) i
tecne stacionarne faze koja je naneta na inertni
nosac. Ravnoteža izmedu mobilne tecne i
stacionarne tecne faze (koje se ne mešaju)
odreduje separaciju razlicitih supstanci iz smeše.
Separacija komponenata iz smeše se bazira na
njihovoj preraspodeli izmedu dve tecne faze
(relativnoj rastvorljivosti komponenata smeše)
Ispitivana supstanca rastvorena u tecnoj
stacionarnoj fazi koja se nalazi na površini
inertnog nosaca

-normalne faze -obrnute faze
Kolonska tehnika Laminarna tehnika
16
Hromatografija na izmenjivacima jona
Razdvajanje supstanci se vrši izmedu mobilne
tecne faze i specificne cvrste stacionarne faze
(smola) koja sadrži labilno kovalentno-vezane
jone. Joni nosaca se mogu reverzibilno i u
ekvivalentnim kolicinama vezivati i zamenjivati
drugim jonima iz rastvora elektricnim silama.
Mobilni anjoni se zadržavaju u blizini katjona
koji su kovalentno vezani za nosac (stacionarnu
fazu)
Anjon-izmenjivac
Katjon-izmenjivac
Anjon-izmenjivacka smola samo anjoni mogu biti
privuceni

17
(No Transcript)
18
Hromatografija na molekulskim sitima
Mobilna tecna, ili gasna faza prolazi kroz
porozni gel koji ima ulogu separatora molekula iz
smeše na osnovu velicine. Pore su najcešce veoma
sitne cime se veliki molekuli iskljucuju.
Rezultat ove separacije je da veliki molekuli
brže prolaze kroz kolonu i zajedno sa mobilnom
fazom izlaze sve molekulske vrste dimenzija vecih
od dimenzija pora.
Molekulska sita visoko umrežena nerastvorna
organska jedinjenja u obliku gela
Veliki molekuli se odvajaju
Gel-filtracija
Porozne partikule nosaca
Kolona
Mali molekuli prolaze kroz pore partikula nosca
Mali molekuli
Veliki molekuli
Kolonska tehnika
Molecular exclusion chromatography
19
Afinitetna hromatografija
Veoma selektivna. Pogodna za izdvajanje
komponenata iz biohemijskih smeša. Razdvajanje
bazira na interakciji izmedu specificne vrste
molekula iz rastvora i molekula koji su
imobilisani na stacionarnoj fazi npr. imobilisani
molekul na stacionarnoj fazi može biti antitelo
za izdvajanje specificnog proteina.
Specifican molekul u smeši vezuje se za
kompatibilan molekul kovalentno vezan za
stacionarnu fazu
Ostali molekuli prolaze kroz kolonu

20
Afinitetna hromatografija
Bazira na visoko specificnoj biološkoj
interakciji, npr. izmedu antigena i antitela,
enzima i supstrata, receptora i liganda.

• Pogodna za
• -precišcavanje molekula iz smeše
• smanjenje koncentracije pojedinih molekula iz
  smeše
• odredivanje vrste bioloških materija koje vezuju
  specificne molekule

21
Klasifikacija hromatografskih metoda
TLC
Hromatografska komora
Rastvarac
Rastvarac


22
Klasifikacija hromatografskih metoda
TLC
TLC mastila
TLC automatski sistem
23
Pri hromatografskom razdvajanju supstanci u
koloni, dužina puta lconst, hromatogram
predstavlja zavisnost koncentracije od vremena
ili zapremine mobilne faze. Kvalitativna i
kvantitativna analiza hromatograma.
24
Gasna hromatografija
Kolonska tehnika
Adsorpciona Podeona veca primena
Supstance koje se ispituju su na sobnim
temperaturama u gasnom obliku, zagrevanjem
prelaze u gasno agregatno stanje, ili se
specificnim reakcijama mogu prevesti u isparljiva
jedinjenja.
Razdvajanje se odvija izmedu mobilne faze (gas
nosac) i stacionarne tecne faze (nalazi se na
sprašenom inertnom nosacu, ili prekriva unutršnji
zid kolone) ? razliciti koeficienti raspodele
(rastvorljivosti) eluaciona analiza.
Kvalitativne karakteristike ? retencina vremena
(zapremine) Kvantitativne karakteristike ?
površine (visine) pikova
25
Klasifikacija hromatografskih metoda
Gasna hromatografija Gas chromatography GC
Analiticka tehnika za separaciju komponenata iz
smeše koje su prisutne, ili se mogu dovesti
(zagrevanjem) u gasno agregatno stanje. Iz
hromatograma se dobijaju podaci o kvalitativnom i
kvantitativnom sastavu smeša (uzoraka).
Prolazeci pod visokim pritiskom u gasnom obliku,
komponente se razdvajaju i raspodeljuju izmedu
stacionarne faze (može biti tecna, ili cvrsta) i
mobilne faze koja je gas. Razlicita preraspodela
(vremenska i prostorna) komponenata u
stacionarnoj fazi rezultira hromatogramom.
26
(No Transcript)
27
Gas-nosac
Helijum Azot Argon 15 MPa
Injekcioni blok
28
Gasna hromatografija
Gas nosac Helijum Argon Azot
Kolone Preparativne Analiticke Punjene
inertni nosac impregniran likvidnom
fazom Kapilarne
Standardne punjene kolone imaju precnik 1.5 10
mm, dužinu nekoliko metara, sadržaj likvine faze
5 30, inertni nosac ima precnik cestica 100
500 ?m
Standardne kapilarne kolone mogu imati unutrašnji
zid prevucen likvidnom fazom, ili unutrašnji zid
prevucen likvidnom fazom u koju je speašen
inertni nosac. Unutrašnji precnik je do 1 mm, a
dužina do 200 m
29
Klasifikacija hromatografskih metoda
Visokopritisna tecna hromatografija High
performance liquid chromatography HPLC
Jedna od najmocnijih metoda u analitickoj
hemiji. Izdvaja, identifikuje i kvantifikuje
komponente iz smeša (uzoraka) koje su
rastvorljive u tecnosti. Mogu se izdvojiti
komponente smeša koje su prisutne u tragovima
(milioniti, bilioniti deo). Primena u
farmaceutskoj, kozmetickoj, prehrambenoj
industriji, forenzici, ekologiji...
30
(No Transcript)
31
Klasifikacija hromatografskih metoda
HPLC SISTEM
32
(No Transcript)
33
(No Transcript)
34
Centrifugiranje
Centrifugiranje je sedimentacija cestica pod
uticajem centrifugalne sile i upotrebljava se za
razdvajanje vrlo finih suspenzija. Kod
centrifugiranja se koriste sile do 10 000 puta
vece od sile gravitacije, a kod ultracentrifuga i
do 600 000 puta vece.
Upotreba -kada se iz koncentrisanih suspenzija
izdvaja cvrsta supstanca ili se iz emulzije
izdvaja disperzna faza od disperznog sredstva
bubanj se okrece velikom brzinom na
horizontalnoj ili vertikalnoj osovini
35
Centrifugiranje

• Brzina kretanja cestica je u funkciji rezultanti
  sila koje ubrzavaju i koje usporavajukretanje
  cestica u datom sistemu.
• Sila koja ubrzava kretanje cestica je
  centrifugalna Fc, dok su sile koje usporavaju
  kretanje cestica sila potiska i sila unutrašnjeg
  trenja.