Introducci

1
Introducción a la espectroscopía vibracional
Espectro electromagnético
Frecuencia (Hz) Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición
1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear
1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos
1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos
4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos
1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones
108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones
100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin
2
Estados vibracionales y energía
Frecuencia de la vibración k constante de
fuerza del enlace F -kx µ masa reducida,
para un sistema diatómico
3
Modos normales de vibración (3N - 5)
cm-1 IR RAMAN
estiramiento (sim) 1340 -
estiramiento (asim) 2349 -
deformación 667 -
deformación 667 -
4
INFRARROJO
Reglas de selección No todas las vibraciones
serán activas en IR Sólo aquellas en las que
cambie el momento dipolar permanente durante la
vibración
5
INFRARROJO
6
INFRARROJO
N-H
C-H
CO
7
FTIREspectrometría IR con Transformada de
Fourier

1. Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe
   pasar por un monocromador.
2. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da
   mucha mayor rapidez
3. Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1
4. Los espectros pasan necesariamente por una
   computadora lo que facilita el análisis y manejo
   espectral

8
Modos normales de vibración del grupo amida
(valores para metilacetamida)
amida II (1567 F)
amida III (1299 M)
estiramiento NH (3236 F)
amida I (1653 F)
amida VI (600 M)
amida VII (206 M)
amida IV (627 D)
amida V (725 F)
estiramiento NC (1096 D)
estiramiento CN y CC (881 D)
deformación CCN (436 D)
deformación CNC (289 D)
9
ovillo estadístico
hélice a
transición a ? b
b antiparalela
Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol
Chem (1967) 242, 5460-5466
10
Estructura a
Estructura b
Goormaghtigh, E Ruysschaert, J. M. and Raussens,
V Biophysical Journal Volume 90 April 2006
29462957
11
Porcentajes de hélice y cadena extendida
obtenidas por rayos X y FTIR
Proteína Hélice Hélice Cadena extendida Cadena extendida
Proteína FTIR RX FTIR RX
Carboxipeptidasa 40 39 33 30
a-Quimotripsina 12 10 50 49
Concanavalina A 4 2 60 60
Lisozima 41 45 21 19
Papaína 27 29 32 29
Ribonucleasa A 21 22 50 46
12
1H2O
2H2O
Efecto de la deuteración de la proteína sobre la
posición de la banda amida I J. Biol. Chem.
(1998) 273 771-777
13


BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa
1682 nCO amida I (hoja b)
1660 nCO amida I (giro)
16511652 1652 nCO amida I (hélice a)
1633 1633 nCO amida I (hoja b)
15861577 15861571 nCO COO Asp o Glu
1547 1547 d N-H amida II
15161517 15161517 n OH anillo Tyr
1443 1455 d N-2H amida II y 2HOH
Asignación tentativa de las diferentes bandas en
el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6
14
Isótopos y posición de las bandas
FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c
aa3 de T. termophilus.
Referencia Pinakoulaki, E. Soulimane, T. and
Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 27732867.
15
Efecto Raman Dispersión inelástica de fotones
Sir Chandrasekhara Venkata Raman, (??????????
???????????) Tiruchirapalli, Tamil Nadu
-7/11/1888  Bangalore, Karnataka - 21/11/1970
Premio Nobel de Física 1930
16
muestra
Láser, luz monocromática
Regla de selección Para que la vibración sea
activa en Raman debe provocar un cambio en la
polarizabilidad de la molécula.
Monocromador, espectrógrafo

• Ventajas de Raman con respecto a IR
• Se mide en el visible o el UV donde los
  detectores son mucho más sensibles
• El agua produce una dispersión Raman muy débil
• La resonancia Raman permite sondear grupos
  asociados a cromóforos con una sensibilidad 102-
  104 veces mayor

17
N
N
18
(No Transcript)
19
Resonancia Raman
estado electrónico excitado
estado energético virtual
Resonancia Raman
Raman
estado electrónico basal
La resonancia Raman es más intensa que la
dispersión Raman, pero necesita que exista un
cromóforo y sólo se intensifican las bandas
debidas al cromóforo
20
Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman
de BSA en solución en amortiguador de fosfato
(rojo).
21
l 406.7 nm
Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur
J Biochem 254(3) 662-70