T

1
Técnica de DNA recombinante

• DNA recombinante ou clonagem
• ligar 2 ou segmentos de DNA, gerando mólecula
  capaz de replicação autônoma em hospedeiro

2
Técnica de DNA recombinante

• Base das técnicas de DNA recombinante
• enzimas que modificam ácidos nucleicos
• síntese, degradação, ligação ou remoção de partes
  dos ácidos nucleicos de forma controlada
• Enzimas
• DNA Polimerases
• Enzimas de restrição - corte
• Ligases - ligação
• Kinases e fosfatases - modificação de terminações
  (alteração de PO4)

3
E. coli
Eucarioto
Plasmídeo
Digestão
Ligação
Transformação
Digestão
4
(No Transcript)
5
Escherichia coli

• Escherichia coli - patogênica a humanos
• cromossomo circular 4.639 Kpb
• http//wit.integratedgenomics.com/
• http//www.sciencemag.org/cgi/content/full/277/533
  1/1453
• cepas derivadas de K-12
• cepas utilizadas
• denominadas por uma ou mais letras números
• JM 109, HB 101, DH5a, DH10, BL21, XL blue,......
• cepas prototróficas ou auxotróficas

6
(No Transcript)
7
Escherichia coli

• Cresce rapidamente a 37oC (ciclo de 20 min)
• Meio mínimo ou rico
• Glucose - melhor fonte de C
• Extrato de levedura - essenciais
• Triptona e Peptona fonte amino ácidos
• Cepas de E. coli - sem plasmídeo
• Introdução de plasmídeo -gt transformação
• tratamento químico (PEG, CaCl2) ou físico
  (eletroporação)

8
Vetores de clonagem

• Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb
• pBR322 pUC pGEM pBluescript pET
• Fago lambda - 0,1 a 18 Kb
• Cosmídeo - 35 a 50 kb
• BAC e YAC - fragmentos maiores
• Insertos genômico, transcrito reverso de mRNA
  (cDNA), subclonagem ou sintético

9
Vetores de clonagem

• Plasmídeos
• DNA circular acessório, auto-replicativo e
  extra-cromossomial
• tamanho de 1 a gt 200 Kpb
• Bacteriófagos ou fagos
• viróides de bactérias
• capaz de replicação dentro de bactérias

10
Vetores de clonagemPlasmídeo

• Manipulação após purificacão
• larga escala
• mini-prep ou lise alcalina
• Características para uso
• origem de replicação
• marcadores de seleção
• resistência a antibiótico (ampR e tetR)
• gene lacZ - amino terminal b-galactosidase
  (complementa)
• IPTG e X - Gal
• sítio múltiplo de clonagem (MCS)
• tamanho (quanto menor melhor!)

11
(No Transcript)
12
pBR322 1o plasmídeo -1977 Bolivar et al 1977
Plasmídeos naturais pBR322 R1 R6.5 pMB1
13
pBR322
14
pUC8 1982 Vieira Messing
15
Plasmídeo

• Sistema lacZ
• Adicionar ao meio
• IPTG isopropil thio galactose
• X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiran
  osídeo (branco/azul)
• Outros sistemas (pZERO)

16
(No Transcript)
17
Vetores de clonagem Bacteriófago (fago) l

• Ciclo de infecção Lítico ou Lisogênico
• Genoma de fago l 48,5 Kpb
• Cerca de 15 Kb opcional - necessário para
  integração no cromossomo de E. coli
• Deleção desse fragmento não afeta ciclo lítico
• Fago mantém ciclo lítico sem esse fragmento
• Dois tipos de vetores
• vetor de inserção remoção DNA opcional
• vetor de substituição fragmento stuffer

18
Lisogênico
Lítico
19
Bacteriófago (fago) l
20
Vetores de clonagem Bacteriófago (fago) l

• Genoma do fago l é linear
• Terminações fita simples de 12 bases - COS -
  seqüências complementares -gt pareamento
• Vetor fago l pode ser circular
• Manipulado como plasmídeo e re-introduzido em E.
  coli por transfecção (baixa eficiência)
• Empacotamento in vitro
• 2 braços lineares ligados a insertos
• adicionar mix de empacotamento (capa ptn)
• partículas fago espontânea DNA de 37 a 52 Kb

21
Vetores de clonagem Bacteriófago (fago) l

• Empacotamento in vitro
• 2 braços lineares ligados a insertos
• concatâmeros
• Adicionar mix de empacotamento (capa ptn)
• Partículas de fago formam espontaneamente
• DNA incluído de 37 a 52 Kb flanqueados por sítios
  COS
• Misturar partículas de fago com E. coli
• Plaquear as células - camada de bactérias
• Lise de bactérias - plaque
• fagos recombinantes -gt restrição tamanho braços

22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
Vetores de clonagemInsertos maiores

• Plasmídeo - acomoda até 10 Kb
• rearranjos ou interfere com replicação
• Fago l - acomoda até 18 Kb
• Cosmídeo - plasmídeo contendo sitío COS
• concatâmeros de moléculas pelo sítio COS
• apenas COS para empacotamento de fago
• partícula reconhece apenas sítio COS
• partículas de fago com cosmídeo - infectivas
• replicação como plasmídeo - colônias
• 35 a 50 kb, conforme cosmídeo (lt 8 Kb) máx 52 kb

25
Z tamanho médio do inserto em pb G tamanho do
genoma haplóide em pb
Manual
26
Cosmídeo pJB 8
27
Vetores de clonagemInsertos maiores

• YACs (yeast artificial chromosome) (Burker et al
  1987)
• Mantido em S. cerevisiae
• Cromossomos - centrômero, telômero e origem de
  replicação
• plasmídeo de 10-15 Kb
• cromossomo original de 230 a 1700 Kb
• acomoda até 600 Kb, máx 1400 Kb
• grande problema de estabilidade e rearranjos
• uso de outros vetores menos instáveis mas
  acomodando fragmentos menores

28
YAC
29
Vetores de clonagemInsertos maiores

• Bacteriófagos P1 ou P1 (Sternberg 1990)
• similar ao fago l
• versão com deleções do fago natural
• fago maior e acomoda fragmentos maiores
• acomoda até 125 Kpb
• BAC (bacterial artificial chromosome) (Shizuya et
  al 1992)
• baseado no plasmídeo natural F
• clonagem de até 300 Kbp

30
Vetores de clonagemInsertos maiores

• PAC (P1 derived artificial chromosomes) (Ioannou
  et al 1994)
• combina características de fagos P1 e BACs
• clonagem de até 300 Kbp
• Fosmídeos (Kim et al 1992)
• contém a origem de replicação do plasmídeo F e
  sítio COS de fago l
• similar a cosmídeos
• menor número de cópias por célula - lt rearranjos

31
(No Transcript)
32
Vetores de clonagemoutros organismos

• Existem vetores específicos para manipulações em
  outros organismos
• outras bactérias
• S. cerevisae
• Camundongos
• Plantas - pBIN 19, série pCAMBIA

33
(No Transcript)
34
(No Transcript)
35
Enzimas de Restrição

• Endonucleases de restrição
• Bacteriófagos - gt vírus infectam bactérias
• 1950s - fagos infectam cepas específicas
• certos fagos restritos a certas cepas (Luria)
• 1962 - endonuclease clivam DNA não protegido
• DNA não protegido degradado por endonuclease
  restringindo infecção
• 1968 - purificação 1a endonuclease de restrição
• 1970 - purificação e caracterização Hin dII
• corte mesmo sítios - mapa de restrição Simian
  Virus 40

36
Enzimas de Restrição

• Organismos possuem sistema de Restrição e
  Modificação associados
• Modificação - metilação de bases
• Enzimas de restrição ocorrem bactérias, vírus,
  alga eucarionte Chlorella

37
Enzimas de Restrição

• Tipos de Enzimas de Restrição/Modificação
• Tipo I - Restrição e Modificação na mesma enzima
  com 2 ou 3 subunidades heterólogas
• Tipo II - sistema R e M separados
• Homodímeros
• 93 das comerciais, outros 5 Tipo IIs
• Tipo III - R e M na mesma enzima

38
Tipos de Terminação
Tipos de Enzimas de Restrição
39
Enzimas de Restrição

• Enzimas de Restrição Tipo II
• reconhecem sítios palindrômicos - 4 a 8 bases
• cortam no interior da seqüência
• enzimas R e M adjacentes no genoma de origem
• requerem Mg2
• normalmente produzem 5-fosfato e 3-OH
• Tipo IIs -possui sítio de reconhecimento rara/
  palindrômico (4 a 7 bases) e corta abaixo (até 20
  pb)

40
Tipos de Terminação
Tipos de Enzimas de Restrição
41
Enzima Seqüência Reconhecimento Tipo
Terminação Seqüências Finais AluI 5'-AGCT-3' Blu
nt 5'-AG CT-3' 3'-TCGA-5' 3'-TC
GA-5' Sau3AI 5'-GATC-3' Sticky, 5' overhang 5'-
GATC-3' 3'-CTAG-5' 3'-CTAG
-5' HinfI 5'-GANTC-3' Sticky, 5' overhang 5'-G
ANTC-3' 3'-CTNAG-5' 3'-CTNA
G-5' BamHI 5'-GGATCC-3' Sticky, 5'
overhang 5'-G GATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 3'-CCTAG
G-5' BsrBI 5'-CCGCTC-3' Blunt 5'-
NNNCCGCTC-3' 3'-GGCGAG-5' 3'-
NNNGGCGAG-5' EcoRI 5'-GAATTC-3' Sticky, 5'
overhang 5'-G AATTC-3' 3'-CTTAAG-5' 3'-CTTAA
G-5' PstI 5'-CTGCAG-3' Sticky, 3'
overhang 5'-CTGCA G-3' 3'-GACGTC-5' 3'-G
ACGTC-5' NotI 5'-GCGGCCGC-3' Sticky, 5'
overhang 5'-GC GGCCGC-3' 3'-CGCCGGCG-5' 3'-CG
CCGG CG-5' BglI 5'-GCCNNNNNGGC-3' Sticky, 3'
overhang 5'-GCCNNNN NGGC-3' 3'-CGGNNNNNCCG-5' 3
'-CGGN NNNNCCG-5
42
Enzimas de Restrição

• Nomeclatura
• Nome específico do organismo
• 1a letra o gênero 2 letras espécie 3 letras
• próximo letra da identificação da cepa
• numeral romano indica ordem de identificação
• Escherichia coli Eco R I
• Haemophilus influenza Hin d III

43
Enzimas de Restrição

• Sítios de Reconhecimento de Tipo II
• palíndrome de 4 a 8 base com eixo rotacional de
  simetria
• EcoRI - GATTC
• interrompido
• SfiI - GGCCNNNNNGGCC
• AccI - GTMKAC - M A ou C K G ou T
• Sítio de Reconhecimento Tipo IIs
• Mbo II - GAAGA cortando 8 bases 3 e 7 bases 5

44
Enzimas de Restrição
Enzimas de restrição
45
Enzimas de Restrição

• Reação de Digestão ou Restrição
• Tampão típico
• MgCl2 - requerimento absoluto
• NaCl ou KCl - força iônica
• Tris-Cl - manutenção pH
• b-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) -
  estabilização
• BSA - estabilização
• Específico para cada enzima
• Problema - digestão ou reação múltiplas

46
Enzimas de Restrição

• Tampão UNIVERSAL
• Glutamato de Potássio
• afeta eletroforese
• Acetato de Potássio
• Tris-acetato
• baseado em análises de tampões celulares
• One-Phor-ALL - Amersham
• Multi-core - Promega
• Várias enzimas mantêm atividade
• T4 DNA ligase, T4 DNA polimerase

47
Enzimas de Restrição

• Reação
• 1 unidade - 1 mg de DNA
• DNA - s/ contaminações de fenol, álcool,
  detergentes, EDTA, sais, polissacarídeos
• estoque com 50 glicerol - máx 10 volume de
  reação
• glicerol não pode ultrapassar 5 do volume
• parar reação - adicionar EDTA, aquecer (65oC) ou
  extrair com fenolclorofórmio
• enzimas mantidas máximo de tempo a -20oC (RT)
• evitar contaminação

48
Enzimas de Restrição

• Atividade não específica - STAR
• sob condições não padronizadas extremas enzimas
  perdem especificidade de sítio
• específico para cada enzima
• alta concentração de glicerol gt5
• alta relação U de enzima/mg DNA gt100 U/mg
• Baixa força iônica (lt 25 mM)
• Alto pH (gt8,0)
• presença solventes ôrganicos (DMSO, etanol, EG)
• substituição de Mg2 por cátions (Mn, Cu, Zn, Co)

49
Enzimas de Restrição
http//rebase.neb.com
50
Enzimas de Clonagem

• LIGASES
• ligar ou juntar ácidos nucleicos
• clonagem de fragmento de DNA em vetor
• FOSFATASES
• remover grupo 5 fosfato de fitas de DNA
• prevenir de re-ligação de vetor
• produzir substrato para quinase adicionar 32 PO4
• QUINASES (Kinases)
• adicionar grupos fosfato - marcação 32P

51
Ligases

• T4 DNA ligase ligar ou juntar ácidos nucleicos
• clonagem de fragmento de DNA em vetor

5
OH 3
5 P
OH 3
P 5
3 OH
3
5
Mg 2, ATP
5
OH 3
3
5
52
Papel in vivo
53
Ligases

• Função biológica
• produzida por fago T4 em E. coli
• ligar intervalos na replicação de DNA (Okazaki)
• reparo de DNA e recombinação
• Catalisa a formação de ligações fosfodiéster
  entre nucleotídeos e hidrólise de ATP-gtAMP PPi
• DNA ligase age em dsDNA ou RNA em duplex
• ligação em terminais coesivos ou abruptos ou
  nicks
• RNA ligase age em ssRNA ou ssDNA/RNA

54
Ligases

• Ligase catalisa a ligação de segmentos de DNA ou
  RNA formando ligações fosfodiéster entre 3 OH e
  5 fosfato
• Requer fonte de energia - ATP
• Ligação entre terminais abruptos ou coesivos

...TGGTATCTGTGTGACTGATOH P
TAGCAGGCCATCC.... ...ACCATAGACACACTGACTAP
OHATCGTCCGGTAGG...
..CTTGATGGTATCTGTGTGOH P
AATTCCTCAAGAACTGGACTTC.. ..GAACTACCATAGACACACTTAAP
OH GGAGTTCTTGACCTGAAG..
55
Ligases
56
Ligases

• T4 DNA de bacteriófago comumente usada na
  construção de recombinantes
• Requer ATP como co-fator
• Não utiliza NAD (E. coli DNA ligase)
• usada em quebras ou ligação coesivas e não
  abruptas
• Para reações intermoleculares requer que uma
  possua 5-fosfato
• Usada ligar ssDNA (oligos) adjacentes -
  mutagênese sítio dirigida

57
Linkers x adaptadores abrupto -gt coesivo digestão
Homopolímero tailing terminal deoxinucleotidil
transferase
DNA polimerase independe/ terminal
deoxinucleotidil transferase calf thymus
58
Fosfatase

• Remover o grupo fosfato 5
• Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)
• prevenir re-ligação de vetor de clonagem
• produzir substrato para quinase

OH 3
5 P
3 OH
P 5
OH 3
5 OH
3 OH
OH 5
59
Fosfatase

• Uso
• retirar grupo fosfato dos terminais 5 do vetor
  para prevenir auto-ligação durante clonagem
• apenas uma fita precisa estar ligada antes de
  introduzir plasmídeo na bactéria
• inserto não deve estar desfosforilado
• remoção de fosfato - melhora marcação
• Mais usada
• Calf Intestinal alkaline phosphatase (CIAP)

60
(No Transcript)
61
Kinase

• Adicionar novos grupos fosfatos a ácidos
  nucleicos (ex. marcação radioativa)
• T4 Polynucleotide kinase
• Permite troca de grupos fosfatos

5 OH
OH 3
3 OH
OH 5
Mg2, g-32P ATP
OH 3
5 P
3 OH
P 5
62
Kinase
5 OH
OH 3
Mg2, g-32P ATP
OH 3
5 P
5 P
OH 3
ADP, Mg2, g-32P ATP
OH 3
5 P
63
Kinase

• Uso
• transfere grupo g-fosfato de nucleotídeo
  trifosfato (ATP) para o terminal 5
• usada para fosforilar DNA sintético para
  facilitar ligação
• marcação de sondas com g-32PATP
• capacidade de troca de fosfato P-5 -gt 32P-5
• Mais usada
• T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)

64
Kinases
65
Clonagem

• ETAPAS
• 1. Preparação do vetor
• 2. Ligação do vetor e inserto
• 3. Transformação de hospedeiro
• 4. Seleção de clones

66
Preparação do vetor

• Digerir plasmídeo purificado com 2 enzimas de
  restrição do MCS
• gerar terminais compatíveis com inserto
• clonagem direcionada
• coesivo abrupto 2a opção

67
Preparação do vetor

• Ausência de sítio de enzima no inserto
• digerir com enzima e tornar abrupto
• usar Klenow (DNA polimerase I) ou T4 DNA
  polimerase para preencher 5 proeminente
• atividade polimerase 5-gt 3
• usar T4 DNA polimerase para remover 3
  proeminente
• atividade exonuclease 3-gt 5 na presença de dNTPs

AATTCCTCAAG DNA polimerase I dNTPs
gt AATTCCTCAAG OH GGAGTTC T4 DNA
Polimerase OH TTAAGGAGTTC
68
Preparação do vetor

• Estratégia alternativa
• usar ligar linkers às extermidades com sítio de
  restrição desejado
• Clonagem de produto de PCR
• Usar sítios de restrição no primer
• 4 nt do terminal 5 para permitir digestão
• Usar artefato de adicionar extra Adenina no 3
  pela Taq polimerase (ausência 3-gt 5
  exonuclease)
• vetor contém extra Timina no 3 (ex. pGEM-T)

69
Preparação do vetor

• Ligação com terminação abrupta ou enzima de
  restrição única -gt defosforilar
• Prevenir auto-ligação do vetor
• CIAP - 0,01 unidades/picomole de terminação
• mg DNA x 3,04 pmoles de terminação
  (kb do DNA)
• Inserto deve estar fosforilado no 5
• fragmentos de digestão - OK
• produto de PCR ou sintético - fosforilar

70
Preparação do vetor

• Purificar inserto e vetor
• Vetor não digerido - falsos transformantes
• Purificar por gel eletroforese
• kits comerciais
• saco de diálise

71
Ligação

• Eficiência avaliada por transformantes
• Condições
• relação molar inserto vetor (31 a 13)
• (ng de vetor x tamanho inserto em kb) x
  (insertovetor) tamanho vetor kb
• total de DNA
• tamanho do inserto
• unidades de ligase
• concentração de ATP e Mg2
• tempo e temperatura de incubação

72
Ligação

• Total de DNA em reação de ligação
• 1 a 10 ng/ml reação (10 a 200 ng total em 20 ml)
• ligações mais difíceis - mais DNA
• Condições
• balanço entre tempo e temperatura (ótimo 25oC)
• função tipo de terminação - função da Tm
• coesivo 15-20oC por 3 a 16 hs
• abrupto 4-16oC por 4 a 18 hs
• em geral 20oC por 30 minutos

73
Ligação

• Reação de ligação
• requer ATP 0,01 a 1 mM - muito lábil!
• não descongelar muito e vortexar - gradiente
• requer 10 mM MgCl2
• EDTA quela - inibe atividade da T4 DNA Ligase
• ativa nucleases - cepas que não são endA-
• tratar com fenol-clorofórmio
• Controles
• apenas plasmídeo - taxa de religação
• apenas inserto - contaminação

74
Transformação e Seleção

• Eficiência
• ufc na placa x 103 ng x diluição ufcng de
  vetor mg mg DNA
  
• Ex. 100 ml céls. em 1 ng plasmídeo
• 10 ml solução (0,1 ng) em 990 ml SOC
• 100 ml plaqueado 100 colônias
• plasmídeo não digerido -gt 109 ufc/mg
• ligação abrupta -gt 105 ufc/mg
• ligação coesiva -gt 106 ufc/mg