WESTERN BLOT http://www.wiley.co.uk/reecegenes/animations.html Ist die Bezeichnung f

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WESTERN BLOT http//www.wiley.co.uk/reecegene
s/animations.html Ist die Bezeichnung für eine
Methode, bei der elektrophoretisch aufgetrennte
Proteine aus einem Trenngel auf ein
Trägermaterial übertragen werden um dann z.B.
mittels Antikörper nachgewiesen zu werden.

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Although gel electrophoresis is a relatively
simple technique, it is not a trivial
procedure.David E. Garfin, Electrophoretic
Methods(even more true for blotting...)
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Nachweis von Proteinen aus

• Blut (z.B. Virusinfektion, Schwangerschaftstest)
• Zellen
• Geweben
• Harn ( Blasenentzündung)
• Lebensmittel (Toxine)

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Übersicht

• 1. Probenvorbereitung
• 2. Elektrophorese
• 3. Blotting
• 4. Nachweis
• 4.1 Blockierung
• 4.2 Bindung primärer Antikörper
• 4.3 Waschschritte
• 4.4 Bindung sekundärer Antikörper
• 4.5 Waschschritte
• 4.6 Substratreaktion
• 5. Kontrollen
• 6. Weitere Tipps
• Anhang

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Probenvorbereitung

• Bestimmung der Proteinmenge mittels verschiedener
  Messmethoden möglich
• 1.) Bradford
• 2.) Biuret
• 3.) Christian Warburg (photometrische
  Differenzmessung)

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Bradford (Comassie Blue)

• Triphenylfarbstoff
• Absorptionsmax 465 nm (Rot)
• WW mit Protein in saurer Lösung
• Absmax shiftet zu 595 nm (Blau)
• Farbänderung durch Stabilisierung des
  Farbstoff-Anions mittels hydrophober und
  ionischer WW mit dem Protein
• Farbstoff reagiert mit
• Arginin!!!
• Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan,
  Phenylalanin
• Messbereich 0,2-1,5 mg/ml
• Ungeeignet für kleine basische Polypeptide
• Detergenzien über 0,2 stören die Messung (NaOH,
  SDS)
• Globulin für Eichgerade geeignet
• Nachteil destruktiv!!!

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Biuret

• Biuret Reagenz enthält CuSO4 in alkalischer
  Lösung
• Cu Ionen bilden mit den Peptidbindungen einen
  blauen Komplex
• Messung bei 546 nm
• Messbereich 1-10 mg/ml
• Nachteil destruktiv

Warburg-Christian

• Proteine zeigen im UV ein Maximum bei 280nm
  (Tryptophan und Tyrosin)
• 2. Max. bei 200nm, Peptidbindung und einige AA
• Nukleinsäuren zeigen Max. bei 260 nm
• Berechnung 1,55E (280)-0,76E(260)mg/ml
• Messbereich 1-10 mg/ml
• Vorteil Proteine werden nicht zerstört und
  können für weitere Analysen verwendet werden.

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Probenvorbereitung

• (Bestimmung der Proteinmenge)
• Denaturierung der Proteine
• 1 SDS (Sodiumdodecylsulfat)
• Harnstoff
• Mercaptoethanol
• Dithiothreitol
• andere SH-Verbindungen
• Erhitzen der Proteine (5-10 min auf 95C)
• Einfärben der aufzutragenden Probe mit Comassie
  Blue
• Etwa 15-25 µg Protein/slot auftragen
• 1µg Protein/Bande damit Bande sichtbar ist!

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Elektrophorese

• Trägermaterialien
• Papier
• Acetatfolien
• Agarose
• Polyacrylamidgel
• Polyacrylamidgel (PAGE)
• Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine abhängig
  von
• unterschiedlicher Ladung
• unterschiedlicher Molekulargewichte
• Porengröße des Gels (6-15)

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SDS (Sodium dodecyl sulfate)

• Anionisches Detergens
• Bewirkt folgendes
• Ladungsunterschiede werden aufgehoben
• Wasserstoffbrücken gespalten
• hydrophobe WW werden aufgehoben
• Aggregatbildungen von Proteinen verhindert
• Polypeptidfäden werden gestreckt
• Proteine aus Untereinheiten werden zu Monomeren
• Proteine binden SDS in konstantem Verhältnis
• mit Disulfidbrücken 70-100
• ohne Disulfidbrücken 140

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SDS Gelsysteme

• Eindimensionale Gele
• Einheitliches Gelsystem (kontinuierliches Gel)
• Lämmli Gel (diskontinuierliches Gel)
• Sammelgel zum Konzentrieren der Proben
• Trenngel
• Gradientengele (Porengröße ändert sich linear
  oder exp)
• Mischgele (aus Polyacrylamid und Agarose)
• Zweidimensionale Gele
• OFarrell Gele
• 1. Dimension Auftrennung nach ieP
• 2. Dimension SDS PAGE

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Kontinuierliches Puffersystem

• Gleiche Puffer für das ganze Elektrophoresesystem
• Einheitliches Polyacrylamidgel
• Nachteil
• Proben müssen hochkonzentriert sein
• geringe Probenvolumina
• jede Bande ist so breit wie aufgetragene
  Probenbande

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Diskontinuierliches Puffersystem

• Verschiedene Puffer um pH-Gradienten und
  Spannungsgradienten zu erzeugen
• Stabilisierung der Puffer durch verschiedene
  Polyacrylamidschichten
• Sammelgel (weitporig, geringvernetzt)
• Trenngel (engmaschig, Auftrennung der Proteine
• nach Größe)

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Trenngel

• Auftrennung im Trenngel allein nach Größe des
  Proteins
• Nicht vergessen Standard für Eichgerade!!!
• Achtung monomeres Acrylamid ist hochgiftig!!!

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Färben der Gele

• Zur Sichtbarmachung der Proteinbanden
• Zur Kontrolle ob die Proteine gut gelaufen sind
• Zur Kontrolle ob gleiche Mengen an Protein
  aufgetragen wurde.

Entfärben der Gele

• Damit Gel zum Blotten verwendet werden kann

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Trouble Shooting Elektrophorese

• Prozentigkeit der Gele auf die Proteingröße
  abstimmen, evtl. Gradientengel probieren
• 7,5 Gele 40 200 kDa
• 10 Gele 30 100 kDa
• 12 Gele 15 90 kDa
• 15 Gele 10 70 kDa
• (Werte für SDS-PAGE)
• Gellösungen partikelfrei Salze komplett gelöst
• Gel luftblasenfrei gießen

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Trouble Shooting Elektrophorese

• Slots vorspülen (Gelbruchstücke/Salze)!
• Gleiche Gesamtvolumina und möglichst gleiche
  Proteinmengen auftragen
• Falls möglich Positivkontrolle mitlaufen lassen
  (gereinigtes Protein positiver Extrakt)
• Gel nicht zu schnell fahren, sonst smile-Effekt
  (Wärmeentwicklung!)
• Große Gele kühlen
• Nach Elektrophorese eine Standardlane mit
  Coomassie anfärben

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Blotten

• Übertragung der Proteine von Gel auf
  Nitrocellulose (PVDF)
• Produktion einer Kopie des Gel, wobei die
  Proteine auf dem Filter immobilisiert werden.
• Trennmuster bleibt am Filter erhalten
• Nachdem welches Gel benutzt wurde, Erhaltung der
• Immunreaktivität
• Funktionellen Aktivität (z.B. Enzymaktivität)
• Nach Transfer mögliche Behandlung der Proteine
  mit
• Liganden
• Antikörper
• Enzymsubstraten
• Präparative Reinigung des Proteins möglich (durch
  Ablösen von der Transfermembran)

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Vorteile des Blottens

• Qualitative Bestimmung des Proteins
• Quantitative Bestimmung des Proteins
• Präparative Reinigung
• Indentifizierung (z.B. mittels Antikörper
  Immunoblotting)
• direkter Nachweis
• Enzym konjugierte Antikörper (HRP, ß-Gal..)
• anders markierte Antikörper (Gold, Biotin,
  Luminiszenz)
• indirekter Nachweis
• ein bereits gebundener, spezif. Antikörper
  wird durch einen Sekundärantikörper (ebenfalls
  markiert) nachgewiesen.

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• Bestimmung der Transfereffizienz
• Anfärben des Gels mit Coomassie Blau oder Silber
  (gt nicht geblottete Proteine)
• Anfärben einer Referenzspur der Membran mit
• Ponceau S Rot (schnell, aber nicht sehr sensitiv)
• Amidoschwarz (2-5fach sensitiver als Ponceau)
• India Ink
• Coomassieblau (nur für PVDF empfohlen)

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Protein-Nachweis Blockierung

• Blockierungsreagenzien (in TBS oder PBS)
• Milchpulver (fettarm, 1 5 )
• BSA (3 5 )
• Casein (1 - 3 für NC, 0,5 1,0 für PVDF)
• Ovalbumin (1 )
• Gelatine (3 , nur NC)
• 0,05 0,1 Tween 20 (nur PVDF)
• Wenn Antikörper gegen Phosphorelierungen
  eingesetzt werden kein BSA oder Milchpulver
  verwenden
• Mind. 0,3 ml Blockierungslösung pro cm² Membran
  für 1 h bei RT (oder ÜN 4C)

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Bindung primärer Antikörper

• 0,5 10 µg/ml primärer AK in Blockierungslösung
  verdünnen (0,3 ml/cm² Membran) optimale
  Konzentration des AK austesten (Kompromiss
  zwischen Signalstärke und Hintergrund)!
• 1 ( 2) Stunden inkubieren, je nach Affinität und
  Konzentration des AK

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Waschschritte

• Abhängig von der Affinität des AK und auch der
  Spezifität kann/muss mehr oder weniger stark
  gewaschen werden
• Polyklonale Seren sind weniger anfällig gegenüber
  zu starkem Waschen
• Monoklonale Seren zeigen weniger
  Kreuzreaktivitäten

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Bindung sekundärer Antikörper

• Vom Hersteller empfohlene Konzentration vom sek.
  AK in Blockierungslösung einsetzen (mind. 0,3
  ml/cm² Membran)
• 0,5 - 1 Stunde inkubieren

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Substratreaktion

• Meerrettich-Peroxidase (HRP)
• Sehr schnelle Reaktion nimmt schnell ab
• Alkalische Phosphatase (AP)
• Reaktion beginnt langsamer, hält dafür länger an
  ist insgesamt stärker
• Chemoluminineszenz ca. 10fach sensitiver als
  Colorimetrie

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Vergleich HRP AP Chemolumineszenz

1. AP-Substratblatt
2. AP-Substrat flüssig
3. HRP-Substrat

Die Fläche unter der Kurve ist proportional zur
Schwärzung des Films!
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Summary-Western Blot

• Technik zum Nachweis von Proteinen
• Qualitativ
• Quantitativ
• Präparativ
• Häufige Anwendung in der Diagnostik
• Viren
• Bakterien
• Allergene
• Hormone
• Einfache Methode