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Biotechnologie v

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... cellulaire Utilisation de protoplastes en recherche Transport membranaire Adressage prot ique Protoplastes tissu ... Culture des plantes : En ... Plant J . Prom ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: Biotechnologie v


1
Biotechnologie végétale
  • Cultures in vitro de plantules Suspensions
    cellulaires et protoplastes Des outils pour la
    recherche fondamentale

2
Exemples dutilisation en recherche fondamentale
  • Cultures de plantules in vitro
  • Approches pharmacologiques et toxicologiques
  • Suspensions cellulaires et protoplastes
  • Échanges membranaires, mécanismes signalétiques
  • Adressage protéique
  • Dédifférenciation, Différenciation
  • Contrôle du métabolisme

3
Approches pharmacologiques sur plantules
  • Déterminisme hormonal de la formation de racines
    secondaires

Zhu et al.
4
Utilisation des suspensions cellulaires dans un
contexte de signalisation cellulaire
5
Hypersensitive Response (HR)
Interactions plantes / pathogènes
Réaction rapide
À plus long terme
HR Mort cellulaire Circonscription du pathogène
SAR Systemic Acquired Resistance
 Immunisation des plantes 
6
Exemple typique infection par le virus de la
mosaïque du Tabac
3 jours dinfection
Lam et al. (2001) Nature
Nécroses mort cellulaire Restriction de la
propagation du virus
7
Caractéristiques histologiques de la réaction
hypersensible
Composés phénoliques (autofluorescence)
Callose
Mort cellulaire (Bleu Evans)
H2O2
Ehrenfeld et al. 2005 Mol. Cells
8
Inconvénients du modèle plante entière
  • Culture des plantes
  • En serre dépendance des saisons
  • Chambres de culture coûteux
  • Variabilité importante
  • Dosages enzymatiques difficiles
  • Problèmes de pigments
  • Mesures de flux difficiles
  • Utilisation difficile dinhibiteurs

9
Utilisation de suspensions cellulaires
  • Quantification de la mort cellulaire
  • Utilisation dinhibiteurs
  • Petites quantités
  • Rapidité dabsorption
  • Facilités dextraction et dosages
  • Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS, NO)
  • Activités enzymatiques
  • Extractions dARN

10
Estimation de la mort cellulaire
  • Colorants
  • des cellules vivantes
  • Fluoresceine diacétate
  • Rouge neutre
  • des cellules mortes
  • Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de propidium
  • Comptages sous microsope
  • Comptages par fluorimétrie

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Mort cellulaire Nicotiana tabacum/ Phytophtora
cryptogea
H2O
Cryptogéine
Prélèvements et comptage de la mort cellulaire au
cours du traitement
Cryptogéine
mortalité
Témoin
heures
12
Recherche dévènements précoces
Cryptogéine
mortalité
Témoin
heures
Que se passe-t-il pendant ces premières heures?
13
Synthèse des composés phénoliques
Transcription du gène codant la PAL
Zhang et al. 1998 Plant Cell
14
Suivi des concentrations ioniques intracellulaires
  • Exemple du calcium

15
Sondes calciques
16
Pénétration des sondes
  • Problème sondes chargées négativement,
    imperméantes
  • Solution dérivation avec un groupement
    acétométhylester (AM)
  • Les molécules pénètrent les cellules
  • Action desterases endogènes
  • Libération des formes actives dans le cytoplasme

17
Inconvénients
  • Sensibilité au pH
  • Compartimentation ?
  • Changements de pH cytoplasmique
  • plus qualitatif que réellement quantitatif

18
Suivi du calcium intracellulaire
  • Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine

19
Mode daction de la coelentérazine
calcium
coelentérazine

O2
Ca2
CO2 ?469nm
apoaequorine
20
Fluctuations de la concentration cytosolique de
calcium
Lecourieux et al. 2002 Plant Cell
21
Elaboration dun modèle de signalisation
cellulaire
Ca2
Cry
Mort cellulaire
Phosphorylations (kinases)
NO3-
NADPH
NADP
H2O2
Modèle très simplifié dune voie de transduction
du signal entre la perception de la cryptogéine
et la mort cellulaire (Nicotiana)
22
Utilisation de protoplastes en recherche
  • Transport membranaire
  • Adressage protéique
  • Protoplastes tissu-spécifiques

23
Étude de transports membranaires
Photoassimilats
Minéraux, H2O
Absorption racinaire Trafic vasculaire Relations
Source / Puit
24
Étude de transports membranaires
  • Problème des suspensions cellulaires
  • Agrégats
  • Paroi végétale
  • Les protoplastes un modèle simple et pertinent

25
Étude de transports membranaires
  • Traceurs isotopiques
  • Sondes fluorescentes
  • Electrophysiologie

26
Traceurs isotopiques
Incubation protoplastes 63Ni 10 µM
Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s
Ni
Ca
Ca
Ca
Ni
Ni
Ni
Ca
Ni
Filtre 0.45µM
Ni
Ni
5 mn
Comptage 63Ni dans le filtre Ni intracellulaire
27
Sondes fluorescentes
Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N
(spécifique du Cd)
Lindberg et al. (2004) Planta
28
Utilisation des protoplastes en électrophysiologie
29
Caractérisation de canaux voltage- dépendants
Les solutés diffusent selon le gradient
électrochimique. Comment caractériser la
régulation électrique de canaux ?
  • Voltage Clamp
  • Patch Clamp

30
Voltage Clamp
Une électrode enregistre les modifications de
tensions La seconde impose une tension et corrige
les variations
Enregistrement des courants ioniques
31
Patch Clamp
  • Mesure des courants sur une surface membranaire
    très réduite
  • forte résistance mesure de courants faibles
  • étude dun petit nombre de canaux

32
Patch Clamp principes
  • Imposition dun potentiel membranaire
  • Mesure dun courant

100 pA
75 ms
pA
mV
Assmann (2001) Plant Physiol.
33
Adressage des protéines
  • Expression transitoire en protoplastes de
    protéines fusionnées avec une GFP

34
Canaux et transporteurs membranaires
  • Souvent faible niveau dexpression
  • Fonction définie essentiellement par
  • Spécificité de substrat
  • Expression tissulaire
  • Adressage membranaire

35
Exemple dune P-ATPase
Greffage dune GFP sur une partie soluble
36
Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria
Spécificité de la GFP pas de groupement
prosthétique synthétisé séparément modification
dacides aminés de la chaîne polypeptidique
Stucture  cannette de feuillets ß 
37
Hexapeptide FSYGVQ
38
(No Transcript)
39
Expression transitoire principe
  • Insérer un fragment dADN codant un protéine dans
    un protoplaste
  • Plasmide
  • DNA double brin ou simple brin
  • Observation directe de lexpression
  • Pas forcément dintégration chromosomique

40
Construction HMA4GFP
Protéine de fusion
Promoteur
HMA4
GFP
2x35S
Ampi
Ori coli
Réplication et sélection dans E. coli
41
Transformation de protoplaste
  • Préparer de grandes quantités de plasmide
  • Transformation
  • MaMg
  • Mannitol (0.5 M)
  • MES-KOH (5 mM) pH 5,6
  • MgCl2 (15 mM)
  • Polyethylène Glycol
  • déstabilisation de la membrane

42
Transformation de protoplastes
300 µl PEG 40
30 min sur glace
0-2 C
Rinçage par dilution / sédimentation NaCl,
CaCl2, Glucose
Dans 300 µl de tampon 106 protoplastes 10 µg de
plasmide 100 µg de  DNA carrier 
43
Expression
  • Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri
  • Incuber 4-48 heures à lobscurité

Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)
44
Un transporteur du plasmalemme AtHMA4
Témoin GFP soluble
AtHMA4GFP
Verret et al. (2004) FEBS Lett.
45
Un transporteur de la membrane tonoplastique
AtNRAMP3
Thomine et al. (2003) Plant J.
46
Isolation de protoplastes spécifiques dune
assise tissulaire
  • Gène rapporteur GFP sous le contrôle dun
    promoteur spécifique dune assise tissulaire

47
Isolement de protoplastes de racines
Tri des protoplastes exprimant la GFP par
cytométrie en flux
Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.
48
Les protoplastes tissu-spécifiques un outil de
recherche polyvalent
  • Electrophysiologie
  • Transcriptomique
  • Protéomique

49
Exemple transcriptome des cellules du centre
quiescent
Nawy et al. 2005 Plant Cell
Fluorescence GFP Contre marquage IP
Tri par cytométrie en flux
50
Hybridation sur puces à ADN
Nawy et al. 2005 Plant Cell
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