Stratgie de criblage pour rechercher des interactants de la calmoduline Anisotropie comme essai de c

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Stratégie de criblage pour rechercher des
interactants de la calmoduline Anisotropie comme
essai de criblage générique

• Pascal VILLA
• PCBIS, STRASBOURG

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Objectifs

• Trouver des petites molécules qui interagissent
  avec une protéine afin de complémenter les
  approches génétiques (Inactivation de gènes ) et
  transcriptomique (Utilisation de siARN)
• Valider la stratégie et la technologie sur la
  calmoduline

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OBJECTIFS de notre INSTITUT C2BIeM
Objectifs
Assembler les compétences et les techniques pour
trouver de  petites molécules  interagissant
avec des protéines. Ces  petites molécules 
constituent des outils de recherche pour
déchiffrer la complexité du vivant ou comme
candidats médicaments.
Méthodes
Explorer lespace chimique (Nature (2004) Vol
432 No 7019 (Insight) pp823-865
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Explorer la signalisation calcique en perturbant
les protéines  actrices  de cette régulation
promazine
Small molecules toolkit
Michael Berridge (Calcium Tool Kit)
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CALMODULINE
Intervient dans la régulation de lhoméostasie
calcique intracellulaire et du rétrocontrôle du
signal calcium
Est extrêmement plastique et peut accommoder
plusieurs modes de liaisons
Hypothèses
? Perturbation de la calmoduline doit induire un
signal calcium
? Différentes molécules doivent pouvoir
 perturber  différentiellement la calmoduline
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CALMODULINE régule lentrée et la sortie du
calcium
Echangeur
Pump
Pump
Pump
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CALMODULINE est très plastique
Channel
Kinases
Kinases
Drug
Pump
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Antagonistes de la calmoduline Diversité des
structures
Ro 22-4839
CGS 9343B
W7
Calmidazolium
Trifluoperazine
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MISE EN PLACE dun ESSAI GENERIQUE
Objectifs
Collection de molécules
Méthodes
Essais (détection de linteraction)
Collection de cibles
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Méthodes pour détecter linteraction
Lumière dépolarisée
Rotation rapide
Excitation
Ligand couplé à la lissamine
(faible anisotropie)
Rotation lente
Lumière polarisée
Excitation
Ligand lié
(forte anisotropie)
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Anisotropie et Polarisation
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STRATEGIE pour développer un essai générique

• Une protéine soluble
• Un ligand fluorescent

Collection de ligand fluorescent
Méthode biophysique pour détecter linteraction
Une protéine purifiée ou un domaine
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Collections de molécules spécifiques ou focalisées
Objectifs
Des Molécules
2 brevets
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Le criblage de la collection de molécules
fluorescentes donne les premiers ligands
Kd0,1µM
Kd1 µM
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Première étape
? Premier ligand fluorescent . Différents ligands
fluorescents peuvent explorer différentes zones
dune protéine
? En général, un des deux isomères (ortho ou
para) a une meilleure affinité pour la protéine.
La lissamine participe à la liaison mais la
lissamine seule a une très faible affinité. Le
ligand est composé de deux fragments.
? Lexistence dun premier ligand permet de
développer un essai par compétition
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ESSAI par Compétition ( 2ième étape)
15 µL 4µM Proteine sonde 0,2 µM
15 µL composé à cribler 20µM
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Exemple de touches sur la collection de Prestwick
Touches validées
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Criblage sur les 6000 composés de la Chimiothèque
de STRASBOURG
405
420
405
395
395
380
377
340
337
300
mP
260
Dilution effect
220
4 µM
2 µM
377
180
337
140
0,0
0,1
1,0
10,0
CaM
µM
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Quelques résultats sur la Calmoduline

• Environ 70 molécules dans la chimiothèque
  patrimoine qui interagissent avec une affinité
  allant de 10 nM à 1 µM
• Ces molécules appartiennent à des classes
  chimiques différentes
• Plusieurs molécules qui sont des modulateurs
  allostériques de la liaison des ligands
  fluorescents et non pas des compétiteurs directs
• Certaines molécules mais pas toutes induisent un
  signal calcium intracellulaire du fait de leurs
  interactions différentes avec la calmoduline.

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CONCLUSIONS

• ?La stratégie utilisant lanisotropie de
  fluorescence et une collection de molécules
  fluorescentes se prête bien au développement dun
  essai sur une protéine purifiée. Cela a été
  réalisé pour des protéines kinases (DAPK) et des
  protéines virales (NSP4) . Cest en cours pour
  dautres familles de protéines.

• Les collections cationiques explorent plutôt les
  zones acides dune protéine.
• Lessai demande beaucoup de protéine (au moins 10
  mg dans la géométrie 96 ou 384 puits)

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PERSPECTIVES

• Construire de nouvelles chimiothèques
  fluorescentes pour explorer les domaines basiques
  des protéines,
• Miniaturiser lessai danisotropie

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Plate-forme de criblage et miniaturisation PCBIS
Strasbourg
Florian REGENSPURGER
Recherche
Andrew Griffiths ISIS J-M Lehn Institute
Production
http//ifr85.u-strasbg.fr/Rubriques/PF/screening.h
tm
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Les possibilités de la microfluidique

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REMERCIEMENTS

• Jacques HAIECH, Marcel HIBERT et Jean-Luc GALZI
• Dominique BONNET
• Pascal VILLA, Florian REGENSPURGER
• Bruno DIDIER, Claire MARSOL
• Christel VALENCIA
• Claire PIGAULT encadrant Rania DAGHER, Michael
  ZIMMERMAN, Pierre-Emmanuel ARCALIS, Romain HANY