Dtermination de la nature dune protine par spectromtrie de masse

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Détermination de la nature dune protéine par
spectrométrie de masse
Samuele Giani Nadji Salhi
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Introduction
Top-down

• analyse dune protéine native

Bottom-up

• analyse des peptides provenant de la digestion
  enzymatique dune protéine

2D-PAGE, Off-gelTM
ESI-MS, MALDI-MS
ICAT
RP-HPLC, CE
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Outils de la protéomique
Électrophorèse sur gel focalisation
isoélectrique
HPLC
Spectrométrie de masse ESI-MS ou
MALDI-MS
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Source ESI
5
Source MALDI

• 1

• 2

• 3

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MS Analyseurs
Temps de vol
Trappe d'ions
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Concepts et buts
But Détermination de la nature dune protéine
inconnue

• lidentification seffectue à partir des bases
  de données

• méthode Bottom-up et Top-down

Montage expérimental
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Concepts et buts
Le microchip home-made pour ESI
Channel 35?m?30?m?2cm Electrode 25?m?75 ?m

• Cellule électrolytique efficace!

? débits, cône Taylor, volume mort
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Bottom-up
Électrochimie rapide et incomplète

• Addition de Michael 1,4

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Bottom-up
Voltammétrie cyclique
MS
Voltammogrammes obtenus sur électrode de carbone
vitreux 3 mm ? À 25 mV s-1 hydroquinoneCystéin
e 2mM
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Bottom-up
Voltammétrie cyclique
MS
Réactions parasites, consécutives, avec O2
Vitesse maximale, pas de réactions parasites
Spécificité avec la Cystéine
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Résultats Top-down
GE

• détermination du pI 4.9 5.4

ESI-TOF-MS

• masse de la protéine native 66400 Da

z1 j(m2-mp)/(m2-m1) M z1(m1-mp)
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Résultats Top-down
TagIdent tool
Database
? ? ? ? ? ? ? ?
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Résultats Bottom-up
Trypsine

• protéolyse après Lys et Arg sauf si après Pro
  on génère nombreux peptideslyophilisation

HPLC

• fractionnement

Marquage

• électrogéneration de carboxyméthylbenzoquinone

MS

• liste de peptides

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Résultats Bottom-up
Recherche dans Mascot
Bovine BSA
Database
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Résultats Bottom-up
Peptides non marqués 75 peptides
Taxonomy all entries, 5 missed cleavages
Taxonomy all entries, 2 missed cleavages
BSA score 76
BSA score 60
BSA score 154
BSA score 172
Peptides marqués 75 peptides 23 compxCys
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Résultats Bottom-up
?
Peptides non marqués 75 peptides
BSA score 76
Taxonomy all entries, 2 missed cleavages
Taxonomy other mammalians, 2 missed cleavages
?
Peptides marqués 75 peptides 23 compxCys
BSA score 172
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Résultats Bottom-up
Peptides non marqués 75 peptides
Peptides marqués 75 peptides 23 compxCys
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Conclusions
Marquage électrochimique

• outil pour lidentification des protéines

• méthode on-line 2 informations

• rapidité

• couplage méthodes de séparation

• analyse de plusieurs protéines limités par
  outils de bioinformatique

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Remerciements
Dr. Christophe Roussel
Loïc Dayon