Recherche et optimisation des amorces pour la PCR

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Recherche et optimisation des amorces pour la PCR
Etape cruciale de la réussite de la PCR
Les amorces doivent être spécifiques, stables et
compatibles
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Amorce gauche et amorce droite
Peut être déterminé à laide de SMS2
Sequence Manipulation Suite 2
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Zone dhybridation unique
Lamorce doit shybrider avec une seule zone de
lADN matrice
Il est nécessaire détablir la carte
dhybridation des amorces avec lADN matrice
Amorce spécifique
EXEMPLE
5-CGACGGACGACG-3
5-TGATACATCGCCGTCGTCGTCGACATCGCCGTCGTACCC
GTCGTCCGTCGGG-3
5-CGACGGCGATGT-3
5-CGACGGCGATGT-3
Amorce non spécifique
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Spécificité de lamorce
Lamorce doit être spécifique du gène ou de
lespèce recherchée. Elle ne doit pas shybrider
avec un ADN contaminant
Pour le vérifier on peut réaliser un alignement
local avec BLAST
EXEMPLE
Letters in Applied Microbiology 2003, 36, 217221
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Longueur des amorces
La longueur de lamorce influe sur la température
de fusion (Tm), la température dhybridation (Ta)
et la spécificité
Spécificité et Tm augmentent avec la longueur
En général 18-30 nucléotides
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Composition des amorces
La composition en bases de lamorce influe sur la
température de fusion (Tm), la température
dhybridation (Ta) et la spécificité
La Tm augmente avec le GC
En général compris entre 40-60
Il faut éviter les zones riches en AT ou en CG,
la répartition des bases doit être de préférence
aléatoire
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Détermination du Tm et Ta
Règle de Wallace
Tm 4 . (nG mC) 2 . (pA qT)
Règle tenant compte de la longueur et les sels
monovalents (M)
Tm 81,5 16,6 . Log(M) 0,41 . (GC) 675
/ L
Melting temperature
Méthode thermodynamique (nearest-neighbour base
model)
Méthode la plus précise car elle tient compte de
la séquence (forces dempilement des bases) et
pas uniquement du GC
Liens pour détermination Tm par différentes
méthodes
Annealingtemperature
Ta 0,3 . Tm(amorce) 0,7 . Tm(amplicon) - 14,9
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Stabilité de lextrémité 3
La stabilité de lextrémité 3 conditionne une
bonne initiation de la polymérisation.
3
5
3
5
Extrémité 3 stable
Extrémité 3 instable
On privilégie la présence de quelques bases GC en
3, mais pas en grand nombre car on risque de
provoquer des fixations non spécifiques
5-TGATACATCGCCGTCGTCGTCGACATCGCTCGTCCGTCG
GTCGTCCGTCGGG-3
5-CGACGGACGAGCG-3
False priming
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Dimères et épingles à cheveux
Les amorces ne doivent pas sautohybrider
(self-dimer) ni shybrider entre elles (dimer),
ni former des structures en épingles à cheveux
(hairpin)
La stabilité de ces structures est évaluée par le
DG.
Liens pour analyser les primers (Netprimer)
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Compatibilité des amorces
Les amorces doivent avoir des Ta proches et par
conséquent des Tm proches
La différence des Ta ne doit pas excéder 2 à 3 C
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Exercice
Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium
dans GENBANK
Recherche damorces simples et vérification de
leur qualité
Recherche damorces optimisées avec Primer3
Recherche damorces optimisées avec PerlPrimer
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Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium
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Résultats
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Séquence du gène invA de Salmonella typhimurium
gtgi154154gbM90846.1STYINVA Salmonella
typhimurium InvA (invA)GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGC
AGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA
ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGA
CCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCG
TCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA
CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGA
CAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACG
CTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT
CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCG
TTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCAC
CGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG
TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAG
ATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCG
CGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT
TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGC
CGGCATCATTATTATCTTTG TGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGG
ATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC
TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCAT
TGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGA
TACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA
ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGA
ACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTT
TAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT
AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGA
GGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTC
TCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG
CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTC
AGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGA
TGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA
ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTG
GTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCC
ATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA
GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGA
TGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAA
TATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT
GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGG
TACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTC
CGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT
GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGA
GCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTAC
GAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC
AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGA
AGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTA
TTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA
TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGG
AGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTAT
AAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA ACATTT
Séquence cible à amplifier (300 nt)
Séquence du gène au format FASTA
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Amorces non optimisées
Amorces déduites des séquences en amont et en aval
gtgi154154gbM90846.1STYINVA Salmonella
typhimurium InvA (invA) GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGC
AGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA
ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGA
CCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCG
TCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA
CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGA
CAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACG
CTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT
CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCG
TTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCAC
CGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG
TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAG
ATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCG
CGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT
TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGC
CGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGA
TGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC
TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCAT
TGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGA
TACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA
ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGA
ACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTT
TAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT
AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGA
GGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTC
TCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG
CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTC
AGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGA
TGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA
ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTG
GTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCC
ATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA
GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGA
TGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAA
TATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT
GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGG
TACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTC
CGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT
GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGA
GCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTAC
GAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC
AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGA
AGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTA
TTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA
TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGG
AGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTAT
AAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA ACATTT
Amorce gauche
5-TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3
Amorce droite
5-CCGCCAATAAAGTTCACAAA-3
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Analyse de lamorce gauche avec Netprimer
Mauvaise amorce formation dépingle, de dimères
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Analyse de lamorce droite avec Netprimer
Mais Tm très différent de lamorce gauche
Pas dépingle, pas de dimères
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Recherche damorces avec Primer3
http//frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm
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Résultats avec Primer3
Plusieurs couples damorces sont proposés
On remarque que le logiciel a trouvé dautres
amorces plus optimisées mais pas à la même
position
Légende cible gtgtgtgtgtgt amorce gauche
ltltltltltlt amorce droite
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Recherche damorces avec PerlPrimer
Il sagit dun logiciel libre téléchargeable
Définir la région à amplifier
Copier/coller la séquence
Visualisation et analyse des amorces
Visualisation de la séquence et des amorces
Recherche des amorces
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Résultats avec PerlPrimer
Analyse de la qualité des amorces
On peut réaliser un Blast directement pour
vérifier la spécificité des amorces
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Résultats de lanalyse avec Blast
Les primers choisies salignenent en uniquement
avec des séquences provenant de Salmonella