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Métabolisme de l'arsenic aspect physiologique et
phylogénétique
Simon Duval
Sous la direction de Barbara Schoepp-Cothenet
BIP09 équipe dévolution des chaînes de
transferts délectron procaryote dirigé par W.
Nitschke
2
Historique de larsenic

• Albertus Magnus isola lélément arsenic en 1250

• Les minéraux arséniés sont utilisés depuis lÂge
  du Bronze et étudiés depuis lAntiquité

• Dès le quatrième millénaire avant JC, les
  historiens constatent que le Bronze est souvent
  composé dun alliage à base de cuivre et darsenic

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Historique

• À lépoque romaine lextraction de lor à partir
  dorpiment Lors de la fonte des minerais
  métallifères pour extraire les métaux, larsenic
  est oxydé en oxyde darsenic (As2O3) ? paralysie
  de certains membres (exdieu du feu Hephaistos)

• Civilisations akkadiennes, égyptiennes, et
  grecques dans des préparations colorantes pour la
  peinture, la cosmétique et lécriture Ces
  minerais furent encore employés par les peintres
  de la Renaissance

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Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Médicament !!!
La toxicité de larsenic très tôt utilisé comme
agent thérapeutique ex Assyriens (2000 avant
JC) Hippocrate (400avant JC) pour traiter
les ulcères LAntiquité comme remèdes
contre le flegme, lempoisonnement, la peur des
fantômes et la lèpre Alchimistes arabes
(700 après JC) traitements de lasthme, des
maladies des poumons, de la peau, et de la
dysenterie et les premiers à l'employer contre la
peste Moyen Âge, produits à base darsenic
sont disponibles chez tous les apothicaires
5
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Médicament !!!
6
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Médicament !!!
Au début du 20 ème siècle, Paul Ehrlich (prix
Nobel de médecine1908) découvrit le 4,4-arsenobis
dihydrochloride encore dénommé arsphenamine plus
connu sous le nom de salvarsan (pendant quarante
ans le médicament de référence pour traiter la
syphilis avant dêtre remplacé par la
pénicilline).
Les composés à base darsenic ensuite remplacés
par des produits moins dangereux. Aujourdhui
encore utilisé comme anti-cancéreux
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Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Poison !!!
Facile à se procurer, sans odeur ni goût, et les
symptômes sont proches de ceux de maladies connues
A lAntiquité, certains textes montrent que les
symptômes dus aux empoisonnement provenait de
l'arsenic
Lâge dor des empoisonnements à larsenic se
situe entre la fin du Moyen Âge et la première
moitié du 19 ème siècle.
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Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Poison !!!
Larsenic a été employé comme arme de guerre.
Les anciens Chinois préconisaient de brûler les
sulfures darsenic pour produire les fumées
toxiques afin dempoisonner larmée ennemie. Ce
type darme préfigurait les gaz de combat à base
darsenic (adamsite et léwisite) utilisés au
cours de la première guerre mondiale
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Actuellement
Agriculture Pesticides, herbicides, fongicides,
insecticides, raticides, défoliants, conservation
du bois
Élevage Alimentations additives, prévention de
maladies (Dysenterie porcine)
Médecine traitement antisyphilitiques,
trypanosomiase, amibiase, anti-cancéreux
Électronique Cellules solaires, semi-conducteur
Métallurgie durcissement des métaux autres
électrophotographies, catalyses, pyrotechnies,
céramiques, verreries
10
Arsenic
11
Arsenic
- Arsenic (As) présent sous 3 formes
Toxicité

Arsine (As III-) Arsénite (As III ) Arséniate
(As V)
-
- Arsenic ? graves maladies
12
Arsenic
- Arsenic (As) présent sous 3 formes
Toxicité

Arsine (As III-) Arsénite (As III ) Arséniate
(As V)
-
Cancer de la peau
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Arsenic
- La principale voie dabsorption (95 des cas)
de larsenic chez lhomme est la voie orale 2/3
par ingestion et 1/3 par inhalation
14
Arsenic
- Le nombre de personnes exposées à larsenic a
conduit lOMS à sintéresser de prés à ce
problème
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Arsenic

• Les microorganismes sont les principaux
  responsables de la transformation (par
  méthylation, réduction ou oxydation) de
  larsenic
• Arsénite oxydase
• Arséniates réductases

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Métabolisme de larsenic
Canal à H2PO4-
pompe
réductase
17
Plan

• 1ère partie caractérisation de l'arsénite
  oxydase
• 1) Etude des potentiels de l'arsénite oxydase
  par RPE
• 2) Etude du partenaire physiologique

• 2ème partie évolution de l'arsenic au cours du
  temps
• Phylogénie de l'arsénite oxydase
• Phylogénie des arséniates réductases

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Partie 1 caractérisation de larsénite oxydase
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Arsénite oxydase
- Gènes d'arsénite oxydase présents aussi bien
chez les bactéries que chez des archées
20
Arsénite oxydase
2 sous unités - Petite de 14kDa (2Fe-2S) AroB -
Grande de 88kDa (Mo et 3Fe-4S) porte le site
catalytique AroA
21
Transfert électronique proposé chez
Alcaligenes faecalis (voltamétrie cyclique)
- Potentiels d oxydoréductions ne sont pas
favorables
0
AsIII/ AsV
- Molybdène peut transférer 2 électrons alors
que les centres 3Fe-4S, 2Fe-2S et cytochrome
c ne peuvent en transférer quun
2Fe-2S
100
Em (mV)
200
3Fe-4S
cyt c ou azurine
300
Mo
? Potentiels sont-ils spécifiques de cette
bactérie?
22
1) Etude des potentiels d oxydoréductions des
centres Fe-S par RPE
23
Etude des potentiels d oxydoréductions des
centres Fe-S par RPE
24
Signaux RPE des centres 3Fe-4S et 2Fe-2S de
l'Arsénite oxydase
25
Titrage RPE du centre 2Fe-2S chez 2
protéobactéries
? Em6 du centre 2Fe-2S estimé à 210 10 mV
26
Titrage RPE du centre 3Fe-4S
Létat du centre 3Fe-4S nest pas stable, même
à 70 K
? Hyp le centre 3Fe-4S serait en interaction
électronique avec le centre Molybdène dont létat
V est stable
27
Inhibition de l'arsénite oxydase par le sulfite
? Le sulfite (Ki 5-10 µM) est un inhibiteur
compétitif de l'arsénite oxydase
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Titrage RPE du centre 3Fe-4S en présence de
sulfite
? Em6 du centre 3Fe-4S estimé à 270 10 mV
29
Recherche du centre Molybdène V

• Aucun signal de Molybdène V trouvé à 55 K
• Sans sulfite
• Avec sulfite

? Hyp signal trop faible, et donc les conditions
ne sont pas optimales pour voir le Molybdène V
30
Conclusions

• Détermination des potentiels des centres
  3Fe-4S et 2Fe-2S
• Em6 2Fe-2S 210mV 10 mV
• Em6 3Fe-4S 270mV 10 mV

? Potentiels toujours pas favorables
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2) Etude de l'accepteur d'électron de l'arsénite
oxydase
L'accepteur d'électron de l'arsénite oxydase chez
Alcaligenes faecalis est une azurine ou un
cytochrome c soluble
Chez NT-26 il existe un cytochrome c552 capable
d'accepter les électrons de l'arsénite oxydase et
qui est homologue au cytochrome de cœur de cheval
Chez NT-14 le cytochrome de cœur de cheval ne
fonctionne pas avec l'arsénite oxydase
32
Etude d'activité chez NT-26 et S22
Cyt Cœur de cheval c550
Cyt c555
DCPIP
Cyt c552 de S22
S22
-



NT-26

-

-
? La même enzyme ne fonctionne pas avec les même
accepteurs chez des bactéries de même famille
33
Comparaison des structures des cytochromes
Charge globale des cytochromes est la même
Chez le cytochrome de cœur de cheval il existe
une boucle supplémentaire ? interaction avec
l'arsénite oxydase différente
34
Conclusions

• Il existe 2 types de cytochromes
• Fonctionnent avec l'arsénite oxydase de S22 et
  qui ne possèdent pas la boucle supplémentaire
• Fonctionnent avec l'arsénite oxydase de NT-26 et
  qui possèdent la boucle supplémentaire

? 2 types d'arsénite oxydase, une du type S22 et
l'autre de type NT-26
35
Perspectives
Etude des propriétés physico-chimique de chaque
type d'arsénite oxydase effet de la
température, du pH, stabilité, Km, Vm
Etude des zones d' interactions arsénite oxydase
- cytochrome par RPE
Etude structurale des 2 types d'arsénites oxydases
36
Partie 2 Evolution de l'arsenic au cours du temps
37
Larséniate réductase
38
Arséniate réductase
Cette réduction se fait à l'aide des produits des
gènes ars ou arr
Les systèmes sont présents chez de nombreux
organismes bactéries, archées et levures

• Il existe 2 types d'arséniates réductases
• Arséniate réductase respiratoire
• Arséniate réductase détoxifiante

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Arséniate réductase respiratoire
Dans ce cas larséniate réductase est en fin de
chaîne respiratoire
40
Arséniate réductase respiratoire
C'est une Molybdoenzyme
Elle possède 2 sous unités ArrA sous unité
catalytique ArrB transfère les électrons (ArrC
ancre membranaire)
4Fe-4S 95 kDa ArrA
4x4Fe-4S 29 kDa ArrB
41
Arséniate réductase détoxifiante
Canal à H2PO4-
pompe
réductase
Dans ce cas larséniate réductase participe à une
simple détoxification
42
Arséniate réductase de type arsC
C'est la famille la plus étudiée
Son activité est dépendante du glutathion et de
la glutaredoxine
Le modèle est l'arsC du plasmide R773 de E.coli
régulateur
pompe
site catalytique
43
Arséniate réductase de type arsC
monomère
44
Arséniate réductase de type pI258
Son activité est dépendante de la thiorédoxine
Elle est proche des LMWP tyrosine phosphatase
Le modèle est le plasmide pI258 de Staphylococcus
aureus
45
Arséniate réductase de type pI258
monomère
46
Arséniate réductase de type Acr2p
Son activité est dépendante du glutathion et de
la glutaredoxine
Elle est proche des protéines de type tyrosine
phosphatase notamment de CDC25
Le modèle est Saccharomyces cerevisiae
acr3
acr2
acr1
pompe
site catalytique
régulateur
47
Arséniate réductase de type Acr2p
CDC25
48
Résumé des différentes arséniates réductases
- Arséniate réductase respiratoire
- Arséniate réductase détoxifiante 1) de type
arsC (type E.coli) 2) de type pI258 (type
S.aureus) 3) de type acr2p (type S.cerevisiae)
49
Arsenic au cours de l'évolution
- Comment ont évolué les enzymes au cours de
l'évolution ?
- L'influence de l'apparition de l'oxygène sur
l'utilisation de l'arsenic par les microorganismes
50
Biosphère primordiale
Atmosphere actuelle
High state
Ozone
Arséniate
Arsénite
Low state
?
LUCA
? O2 ?
Océan
Divergence Archae/Eubactéries
Temps (Mllrd année)
Cyanobactéries Photosynthèse oxygénique
51
Phylogénie

• Etude des relations d'évolution entre organismes
  en comparant
• critères morphologiques
• séquences protéiques, d'ADN ou d'ARN

Arbre phylogénétique illustration d'évolution
entre les organismes d'un groupe ex arbre
phylogénétique universel basé sur les séquences
ARN 16S
52
Arbre phylogénétique basé sur l'ARN 16S
53
I. Arsénite oxydase
Lebrun et al,2003
? arsénite oxydase, une enzyme ancienne
54
II. Arséniate réductase respiratoire
Un Blast nous montre que les gènes arr sont
proches des gènes psr
? étude globale psr-arr
Critères d'organisations
Psr
psrC
psrB
psrA
55
Arséniate réductase respiratoire
Bactéries
Arseniate réductase
ArrA Shean
NarG Staau
ArrA MLMS
ArrA2 Alk eh
NarG Bacli
ArrA Closp
ArrA Alkeh
ArrA Alkme
NarG Eshco
DMSOA Haein
ArrA Desha
DMSOA Ecoli
ArrA Wolsu
DMSOA Actsu
ArrA Sulba
1000
1000
994
982
1000
NarG Psest
ArrA Bacar
469
418
178
Archées
859
429
995
613
ArrA Bacse
ArrA Chrar
1000
1000
ArrA Geolo
1000
1000
NapA Pseae
PsrA Arcfu
NapA Psest
1000
806
509
607
508
203
990
341
881
NapA Desvi
557
508
PsrA Pyrae
1000
995
1000
FdhH Eshco
Polysulfide reductase
560
ArrA2 Halha
997
PsrA Desde
PsrA MLMS
1000
PsrA Carhy
PsrA Geolo
Archées
PsrA Shean
PsrA Wolsu
PsrA Camcu
PsrA Salen
SulTo AO
Bactéries
553
337
998
850
996
ChlFl AO
AerPe AO
1000
969
NT-26 AO
678
ChlLi AO
ChlPh AO
Thiomonas AO
TheTh AO
HerAr AO
Arsenite oxydase
AlcFa AO
0.1
56
Arséniate réductase respiratoire
- Psr et arr de la même famille
- Psr ancien apparu avant la séparation archées /
bactéries
- Organisation dans larbre des arr chaotique ?
transfert latéral intense
? Psr serait lancêtre des arr
57
III. Arséniate réductase dissimilatrice

Type pI258

Type arsC
Type acr2p
? Les 3 familles d'arséniate réductases ont
évolué indépendamment et résultent d'une
évolution convergente
58
Organisation opéronique
a
r
s
B
a
r
s
R
a
r
s
C
a
r
s
A
a
r
s
D
a
r
s
B
a
r
s
C
a
r
s
R
a
c
r
1
a
c
r
2
a
c
r
3
a
r
s
R
a
r
s
C
a
c
r
3
a
r
s
R
a
r
s
C
a
r
s
C
a
c
r
3
a
r
s
C
a
r
s
D
a
r
s
C
a
c
r
3
a
r
s
R
? Nous avons seulement pris les opérons
possédant au minimum arsR, une pompe et arsC


réductase
59
Le site catalytique ars C

Type pI258

Type arsC
Type acr2p
? Bon alignement au sein de chaque famille mais
pas entre elles
60
Comparaison des 3 types darséniates réductases
? La structure est très conservée au site actif
et à proximité de celui-ci dans les 3 types
61
Arbre des arsC
Type acr2p
Type arsC
Type pI258
? Les 3 familles sont indépendantes dans l'arbre
62
Hypothèses
Les structures au niveau du site actif sont très
proches
Les 3 familles sont indépendantes dans l'arbre
Il manque la séquence des ancêtres communs
PTP
Type ars C
Type pI258
Type acr2p
CDC25
63
IV. Les pompes à arsénite

• Il existe 2 types de pompes à arsénite
• Une pompe ArsB
• Une pompe Acr3

Les 2 types de pompes ArsB et Acr3 sont sans
homologie de séquences
La pompe ArsB est apparue la première
phylogéniquement La pompe Acr3 nest présente
que chez la levure et apparue tardivement
64
Les pompes à arsénite sont-elles très différentes?
? Les 2 pompes à arsenic sont en fait assez
proches
La comparaison de séquences nest pas convaincante
65
Pompes de structures proches
? La structure est globalement conservée
66
2 pompes distinctes
ArsB
Acr3
Firmicutes
Déinoccocale
Protéobactéries
? Acr3 est plus fréquente que la pompe ArsB
? Acr3 est plus ancienne que la pompe ArsB
67

• Arsénite oxydase

• Pompe à arsénite Acr3

• Pompe à asIII

Système ars

• As réductase

• PTP

• Polysulfide reductase

Atmosphere actuelle

• Arr

Arsénite
Arséniate
High state
Ozone
Low state
? O2 ?
LUCA
Temps (Mllrd année)
Océan
Divergence Archae/Eubactéries
Cyanobactéries Photosynthèse oxygénique
68
Conclusion
AVANT APPARITION D'O2
- Arsenic présent sous sa forme réduite
(arsénite) ? bactéries doivent se protéger de
l'arsénite

• utilise l'arsénite ? arsénite oxydase
• élimine l'arsénite ? pompe à arsénite de type
  acr3

- D'autres éléments présent qui peuvent être
utilisé par les bactéries

• utilise le sulfite ? polysulfite réductase
• utilise le phosphate ? protéine tyrosine
  phosphatase

69
Conclusion
APRES APPARITION D'O2
- Arsenic est sous sa forme oxydé (arséniate) ?
bactéries doivent se protéger de l'arséniate

• utilise l'arséniate ? arséniate réductase
  respiratoire (arr)
• élimine l'arséniate ? arséniate réductase
  détoxifiante (système ars)

- Arséniate réductase respiratoire apparaît à
partir de mutation de la polysulfide réductase
- Arséniate réductase détoxifiante formée, à
partir d'une pompe à arsénite ancienne (acr3) ou
apparues lors de l'apparition de l'O2 (arsB), et
d'une arséniate réductase arsC provenant d'une
protéine tyrosine phosphatase
70
Conclusion générale
- Etude RPE d'une protéine possédant des centres
Fe-S
- Etude enzymologique d'une enzyme avec calcul
d'une constante d'inhibition
- Etude structurale des cytochromes fonctionnant
avec l'arsénite oxydase
- Etude bio informatique de gènes impliqués dans
la transformation de l'arsenic
- Etude phylogénétique ayant permis d'établir une
théorie sur l'utilisation de l'arsenic par les
microorganismes au cours de l'évolution
71
Merci de votre attention Questions ???