Les virus comme vecteurs th

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Les virus comme vecteurs thérapeutiques
Par Patrick Salmon chercheur au Département de
Microbiologie et Médecine Moléculaire de
lUniversité de Genève
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Thérapie génique quelques applications
Parkinson, Huntington
Mucoviscidose
Hypercholestérolémie Hémophilie
Immunodéficiences Anémies
Dystrophies
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Questions à se poser lorsquon envisage une
thérapie génique Ou
WWW.genetherapy.com
4
WWW.genetherapy.com What? Where? When?
5
WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer?
Quelle est la taille de sa séquence
codante? WHERE? Quelles sont les cellules à
cibler? WHEN? Combien de temps le transgène
doit-il être exprimé? Son expression
doit-elle être régulée?
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Maladies candidates pour la thérapie génique
MALADIE HEREDITAIRES Pathologie Défaut
génétique Prévalence Cible thérapeutique
Immunodéficience ADA, X-SCID rare
CSH ou lympho T
Hémophilie A facteur
VIII 1 10.000 mâles foie, muscle Hémophilie B
facteur IX 1 30.000 mâles CSH, fibroblaste

Hyper-cholestérolémie récepteur LDL
11.000.000 foie familiale Mucovisc
idose CFTR (transporteur 13.000 cauc.
poumon des ions
chlores) Hémoglobinopathies globine 1600
(éthnie!) CSH anémie falciforme,
thalassémie Maladie de Gaucher glucocérébros
idase 1450 (éthnie!) CSH Emphysème
héréditaire a-1 antitrypsine 13.500
foie et poumon
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Maladies candidates pour la thérapie génique

MALADIE ACQUISES Pathologie Prévalence
Cible thérapeutique
Cancer 1 million/an aux USA cellules
cancéreuses ou dendritiques


cellules
présentatrices d'antigènes maladies
dégénératives Parkinson 1 million aux
USA Alzheimer 4 millions aux USA neurones,
cellules gliales
désordres  immunologiques  diabète de
type I dizaines de millions cellules b du
pancréas, autres Cardiovasculaire resténose,
ATS dizaines de millions cellules
endothéliales vasculaires maladies
infectieuses SIDA, hépatite B ou C centaines de
millions CSH, hépatocytes
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• Le vecteur idéal
• Est défini par les exigences thérapeutiques
• (expression stable ou transitoire).
• Peut atteindre de hautes concentrations
  permettant linfection
• de nombreuses cellules.
• Est aisément produit par des techniques
  reproductibles.
• Pour l'expression à long terme, est intégré dans
  un site spécifique
• du chromosome, ou persiste en épisome stable.
• Possède une unité transcriptionelle contrôlable.
• Cible certaines cellules spécifiquement.
• Est dénué de composants induisant une réponse
  immunitaire.
• MAIS un vecteur moins-que-parfait sera souvent
  adéquat...

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Thérapie génique in ou ex?
Isolation
Vecteur
Cellules
Vecteur
Injection
Transplantation
Cellules Génétiquement Modifiées
In vivo
Ex vivo
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Vecteurs pour la thérapie génique

• Viraux
• adénovirus
• virus adéno-associé (AAV)
• rétrovirus oncorétrovirus
• lentivirus
• virus herpes
• virus à ARN (polio, sendaï, etc)
• Non viraux
• ADN nu
• liposomes

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Vecteurs viraux
12
Vecteurs viraux
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Trois familles de virus utilisés pour le
développement de vecteurs
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Adénovirus
AAAH! Grande capacité (30-40 kb) Facile à
produire à hauts titres Infecte les cellules
non-mitotiques
Non-enveloppé Génome ADN Taille 70-90 nm
OOOOH Ne sintègre pas Immunogénique (moins si
 éviscéré ) Peut induire une  acute phase
response 
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AAV
AAAH! Infecte les cellules non-mitotiques LE
VIRUS sintègre à un site spécifique
Non-enveloppé Génome ADN Taille 20-30 nm
OOOOH Faible capacité (4 kb) Difficulté de
production ( dependovirus! ) LE VECTEUR
sintègre au hasard Immunogénicité conditionnée
par la contamination par le virus helper
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AAAH! Capacité raisonnable (10 kb) Facilité de
production adéquate Infecte les cellules
non-mitotiques (LENTIVIRUS) Sintègre Pas de
transfert de séquences codantes virales
Enveloppé Génome ARN-ADN Taille 90-120 nm
OOOOH Sintègre au hasard Ninfecte pas les
cellules non-mitotiques (ONCORETROVIRUS)
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(No Transcript)
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Cycle de réplication du HIV
Fusion
Modifications Post-traductionnelles
Synthèse Proteines
decapsidation
Attachement
Maturation
Export Nucléaire
Retro- Transcription
Assemblage bourgeonnement
Transcription
Import Nucléaire
Intégration
CD4
CCR5 CXCR4
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Transduction par vecteur lentiviral
Fusion / Décapsidation
Rétro-Transcription
Import Nucléaire
Attachement
Intégration
Expression
Endocytose
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Quelques dates marquantes 1996 Un vecteur
lentiviral peut effectuer le transfert,
lintégration et lexpression à long terme un
gène dans les neurones in vivo. 1998
Transduction stable de CSH humaines capables de
reconstituer des souris NOD/SCID. 2000
Traitement de la mucopolysacharidose, du
Parkinson et de la thalassemie dans des
rongeurs. 2002 transgenèse avec vecteur
lentiviral. 2003 Premier essai clinique avec un
vecteur lentiviral.
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NEF
VPR
VPU
GAG
VIF
POL
LTR
Génome HIV-1
LTR
T
A
T
R
E
V
Plasmides dempaquetage lentivecteurs
NEF
VPR
VPU
GAG
VIF
1e génération
CMV
POL
T
A
T
R
E
V
GAG
CMV
POL
2e génération
T
A
T
R
E
V
GAG
CMV
POL
3e génération
RSV
REV
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Vecteur de transfert
vpu
nef
gag
RRE
vif
env
vpr
tat
rev
pol
cPPT
LTR
Y
LTR
dPPT
rev
éléments actifs en cis
LTR
RRE
LTR
dPPT
Y
cPPT
SA
SD
Capacité 10 kb
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Prototypes de lentivecteurs
RRE
cPPT
Y
Ubiquiste
EF1-a
Gene X
RRE
cPPT
Spécifique
Y
gp91phox
Gene X
RRE
cPPT
Inductible
Y
Tet-O
Gene X
RRE
cPPT
Y
Bicistronique
Gene X
Gene Y
RRE
cPPT
Y
Inhibiteur
Gene X
sihRNA
sihRNA
U6
U6
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Production de lentivecteurs
GAG
POL
CMV
An
REV
RSV
An
293T
VSV G
CMV
An
50 TU/cellule x jour
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Lignée stable productrice de lentivecteurs
GAG
POL
CMV
An
REV
Tet
An
VSV G
Tet
An
Dox
30 TU/cellule x jour
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Titration dun vecteur lentiviral

• Titration provirale
• real time QPCR
• 2. Expression du trangène
• FACS, etc

• Décompte des particules
• p24-CA
• Décompte des génomes
• real-time QPCR

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Applications
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Hepatocytes comme cibles de thérapie génique

• Pour le traitement de maladies hépatiques
• Crigler-Najjar type I (Bilirubine
  UDP-Glucuronosyl transferase)
• Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl
  acetoacetate hydrolase)
• Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase)
• Maladie de Wilson (ATP 7B)
• Hépatite viral B ou C (Immunisation
  intracellulaire)
• Comme site de production de protéines systémiques
• Maladies génétiques hépatiques
• Emphysème (alpha-1 Antitrypsine)
• Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX)
• Trouble du métabolisme lipidique (Apolipoprotéines
  )
• Maladies génétiques non-hépatiques
• Diabète type I (Insulin, PDX-I)
• Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase)
• Thalassémie (Erythropoiétine)

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Hypercholestérolémie homozygote
familiale (récepteur low-density lipoproteins
-LDL-)
Réimplantation
Récolte
Transfert de gène
Culture
Purification des hépatocytes
Lobectomie 20
30
FL2
31
0.02
GFP
31
Précurseur myeloide
Neutrophiles, monocytes
Migration (transdifferenciation?)
CSH
Précurseur Lymphoide
Lymphocytes
Précurseur érythroide
Erythrocytes
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Précurseur myéloide
Neutrophiles, monocytes
IL-7
IL-15
IL-7
IL-15
IL-7
CSH
Précurseur lymphoide
Lymphocytes T
Précurseur érythroide
Erythrocytes
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Il-7 et homéostase des lymphocytes T
IL-7
IL-7Ra
gc
JAK3
PI3-K
Bad
STAT5a
P-Bad
STAT3
STAT5b
Bcl-2 Bcl-X
Cyt C
Anti-apoptose
Pro-differenciation
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X-SCID
IL-7
IL-7
IL-15
Lymphocytes T
IL-15
IL-7
CSH
Précurseur lymphoide
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Thérapie génique des  enfants bulles 
Isolation des CSH
Transduction
Transplantation
CSH Génétiquement Modifiées
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Thérapie génique X-SCID
Vecteur MLV (oncorétrovirus) Cibles 2x108
cellules CD34 activées Efficacité de
transduction 30 Fraction de cellules
sanguines positives pour le transgène -
lymphocytes T 100 - neutrophiles 0.1
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(No Transcript)
38
(No Transcript)
39
(No Transcript)
40
Oncogenèse par intégration
Oncogène
Effet enhancer
Effet promoteur
Oncogène
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Leucémie post-thérapie génique X-SCID
Exon 5
Exon 4
Promoteur LMO2
Exon 1
Exon 3
Exon 2
42
IL-15
IL-7
IL-7
IL-7
IL-15
IL-7
IL-7
IL-15
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Thérapie génique X-SCID 11 enfants traités 1 sans
réponse 2 leucémies (1 rémission, 1 rechute) 8 à
la maison avec une vie normale
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Thérapie génique SCID-ADA 4 enfants traités 4
enfants guéris
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• Conclusion les vecteurs viraux peuvent être
  thérapeutiques,
• MAIS

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• Quelques axes de recherche en thérapie génique
• vectorologie (ex ciblage)
• toxicologie (ex oncogenèse)
• immunologie (ex tolérization)
• développement de modèles

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Intégration des vecteurs rétroviraux
HIV
MLV
48
Intégration ciblée