Title: Estabilidad, prdidas y generacin de alcohol etlico en muestras de sangre postmortem
1- Estabilidad, pérdidas y generación de alcohol
etílico en muestras de sangre postmortem
- Dra. Leda Giannuzzi
- Cátedra de Toxicología y Química legal
- Facultad de Ciencias Exactas, UNLP
2Antecedentes
- Los trabajos sobre pérdidas de etanol por
fenómenos putrefactivos son controvertidos. - Coloccia y Argeri (1969) publicaron una
experiencia donde observaron pérdidas totales de
alcohol a los 15 días posteriores a la toma de
muestra con una tasa diaria del 6. - No se mencionan datos sobre el estado del
recipiente o muestra sanguínea en el momento de
recepción y posterior resguardo como ser
existencia de cámara de aire en el recipiente.
3- Otros señalan que las pérdidas de etanol no son
relevantes durante su almacenamiento si las
muestras son convenientemente extraídas y
colocadas en recipientes adecuados y bien
sellados. - Parson 2002, Sreerama y Hardin, 2003, Ferrari,
2003
4- El uso de preservantes como el fluoruro de sodio
en sangre de individuos vivos no mejora mucho los
resultados, más aún si la muestra fue tomada con
jeringa estéril y mantenida a bajas temperaturas.
- En estas condiciones la sangre de personas vivas
puede analizarse aún después de dos semanas sin
variaciones apreciables respecto de la
alcoholemia que se hubiera obtenido en el primer
día. - Winek y Paul, 1989.
5- Otros estudios en muestras de sangre entera y
suero mantenidas por varias semanas a diferentes
temperaturas, indicaron que las muestras
resguardadas a mayor temperatura, mostraban
pérdidas significativas recién a partir de
treinta días (Winek, 1996)
6- La pérdida de alcohol posteriores al óbito y a la
toma de muestra pueden inducir a conclusiones
erróneas en los casos forenses analizados.
7Producción de etanol post-mortem (ONeal y
Poklis, 1996)
- Producción etanol post mortem (100 especies) in
vivo e in vitro. - Candida albicans (boca y piel)
- Glucosa, lactato, manitol, gal, mal, suc, lac
- Hongos Mucor (materia orgánica y suelos)
- Productos volátiles producidos por fenómenos post
mortales n-propanol, butanol, feniletanol.
8- 45 muestras de sangre y tejidos obtenidas de
accidentes fatales en aviones el 95 de ellas
contenían bacterias entéricas capaces de producir
etanol (ampliación rDNA)
9NaF
- 2 estudios concluyen que NaF no es efectivo en
prevenir la formación etanol en sangre de origen
microbiano con alta concentración de Candida
albicans. - Bleme and Lakatua, 1973, Am J. Clin. Pathol.,
700. - Chang, Kollman, 1989, J. Forensic Sci. 105.
10Efecto de la temperatura y NaF sobre la
producción de etanol en tejidos
- Lewis, et. al, 2004, Forensic Sci. Intern. 17
- Rinón y Músculo víctimas accidente aviación T 4
y 25ºC - Con y sin 1 NaF
- t- Butanol (standard interno)
11(No Transcript)
12- Variación de Etanol en músculo (caso 9) durante
el almacenamiento a 4 y 25ºC, con y sin NaF
sin
13- 1. Acetaldehido
- 2. Metanol
- 3. Etanol
- 4 Acetona
- 5. iso-propanol
- 6. t- butanol
- 7. n-propanol
- 8. sec-butanol
- 9. iso-butanol
- 10. n-butanol
- sugiere posible formación etanol por bacterias
14- Se observa formación de etanol a 4 y 25C en
tejidos (rinón, músculo) sin NaF - la velocidad de formación etanol fue menor a
bajas temperatura, pero con el tiempo la
producción de etanol en las muestras almacenadas
a refrigeración son comparables a las de mayor
temperatura. - La formación de etanol es virtualmente eliminado
con 1 de NaF a 4 o 25ºC. - Se observa la formación de compuestos volátiles
acetaldehido, n-propanol, sec-butanol,
isopropanol, acetona, isobutanol. -
15- Comparación en la concentración de etanol en
sangre de cavidad cardiaca derecha, izquierda y
periférica (30 casos) - Grado de putrefacción, daño abdominal,
regurgitación contenido gástrico en vías aéreas. -
- Pilissier Alicot et. al, 2005, Forensic Sci.
International.
16 17(No Transcript)
18(No Transcript)
19- Concentración de etanol en sangre cardíaca
izquierda es significativamente mayor que en el
lado derecho o sobre sangre periférica. - La diferencia en concentración no correlacionó
con el grado de putrefacción, pero correlaciona
con etanol en contenido gástrico. - La mayor diferencia se observa en sujetos con
alta concentración en contenido gástrico y
regurgitación (7, 8, 11, 12, 26 y 27). - Producción endógena de etanol (izquierdo) poco
probable debido haber ausencia de propanol y
etanol en humor vítreo es similar al obtenido en
la cavidad derecho y sangre periférica. - Se acepta que la producción endógena generalmente
no excede 0.3g/L si fue correctamente almacenada.
20- En casos 22, 23, 25 mayor contenido de etanol en
sangre cardíaca derecha que el izquierdo
observandose también alto grado putrefacción y
presencia de n- propanol debido a glucogenolisis
hepática que libera glucosa en la cavidad derecha
vía vena hepática y la vena cava inferior. - Redistribución del etanol desde el estomago 2
mecanismos - a) gradiente de concentración desde estómago al
corazón. Este fenómeno es fácil de entender por
la posición anatómica del estómago y la parte
izquierda del corazón - b) redistribución por vía pulmonar si el
contenido gástrico es aspirado en la vía
respiratoria. Redistribución vía vena pulmonar
hacia la parte izquierda del corazón.
21- Casos en que la concentración de etanol en sangre
periférica fue mayor que en corazón izquierdo y
derecho (10, 25, 30) La autopsia revela
mecanismos de resucitación sin éxito - sangre cardíaca derecha es menos afectada por la
distribución debido a - 1) la sangre de este compartimiento no está
directamente en contacto con el estómago - 2) si es aspirado el contenido gástrico en las
vías aéreas, la difusión principalmente hacia la
vena pulmonar y hacia la parte izquierda del
corazón. - Los resultados presentan considerable valor
práctico sugieren que es preferible sangre
cardíaca del lado derecho mas que el izquierdo
con el objeto de limitar tanto como sea posible
la redistribución en particular si no hay sangre
periférica.
22Humor Vítreo
- García Fernandez (1994) analizaron 30 muestras de
humor vítreo - En doce se obtuvo correlación de la concentración
de etanol en HV repecto sangre - etanolsangre/etanolhumor vítreo 0.7- 0.9 o
invertirse - HV inmune a contaminación bacteriana o a
transformavciones post-mortem
23- Cinética de Degradación de Etanol en muestras de
sangre Forenses
24Objetivos
- Estudiar la evolución del etanol en sangre en
función del tiempo y evaluar fenómenos físicos en
los recipientes donde son contenidos (cámara de
aire) y la temperatura de conservación. - Analizar la influencia de compuestos originados
en la sangre por descomposición de sustancias
orgánicas sobre la concentración de alcohol,
durante el almacenamiento de las muestras
sanguíneas. - Racionalizar a través de un modelo teórico
cinético la estimación de pérdidas en función de
la cámara de aire del recipiente y la
temperatura.
25 2. Materiales y métodos
- Determinación de etanol en sangre individuos
postmortem. - Espacio-cabeza 1 ml de sangre entera previamente
homogeneizada. - Análisis por Cromatografía Gaseoso-FID columna
de acero inoxidable (2 m de longitud, 3 mm de
diámetro interno) empacada con 0.3 Carbowax
1500-graphapack 60/80, isotérmica 100ºC. - Temperatura inicial 35C, 1 minuto y 10C/min de
gradiente hasta 100C temperatura final siendo
la temperatura de inyección y detector de 150C. - Diseño factorial de los ensayos de variación del
contenido de etanol en muestras de sangre
sometidas a diversas condiciones de preservación.
26CA 0, 5, 20, 35 y 65 T almacenamiento 20ºC,
4ºC y 10ºC Diseño factorial (5 x 3), total 15
condiciones de ensayo. Estudio de la cinética de
degradación de etanol a tiempos 0, 3, 7, 15 y 30
días. Alcoholemia 0.5 y 4.30 g/L. Sangre entera
sin preservador Se estudió la generación de
sustancia de putrefacción determinadas por la
relación de áreas señal previa al Standard
interno (amina de putrefacción) y estándar
interno Isopropanol en las muestras de sangre
entera.
27 3 . Controversia entre informes publicados
- Coloccia y Argeri (1969) Pérdidas a tasa
constante 6 y pérdida total en 17 días. - Charles Winek (1996) Aún a altas Temperaturas
las pérdidas no son significativas en 35 d. - Sreerama Hardin (2003) Los envases no cerrados
perfectamente provocan pérdidas de hasta 30. - Parsons (2002) La cámara de aire en recipientes
provocaría pérdidas. - ONeal Poklis (1996) 58 Bacterias pueden
producir etanol post toma de muestra. - Helander Beck (2004) EtG y EtS son buenos
biomarcadores de consumo.
28 Resultados y discusión
Concentración de alcohol etílico (g/L) y relación
entre productos de putrefacción y estándar
interno en sangres enteras almacenadas en
distintas condiciones de temperatura y con
variables de cámara de aire (CA).
29 Con el objeto de modelar el decaimiento del
etanol en función del tiempo, se ensayaron varias
cinéticas siendo la de pseudo-primer orden la que
presentó el mejor ajuste
Integrando ? dC/C ? -ko dt
ko constante aparente de decaimiento de pseudo
primer orden (1/día) C concentración de etanol
a tiempo t Co es la concentración inicial de
etanol (g/ L) t tiempo (días).
30La velocidad de decaimiento del etanol aumenta en
función del incremento del porcentaje de CA y de
la temperatura.
- Un buen ajuste de los datos experimentales se
logró con la cinética propuesta
Cinética de decaimiento del etanol en muestras
de sangre a) 25?C, b) 4?C y c) 10?C, ?0CA, ?
5CA, ?20CA, ?35CA, ?65CA.
31 Parámetros obtenidos del ajuste de la cinética
propuesta con datos experimentales. (R2
coeficiente de determinación).
Se observa que el parámetro ko varía marcadamente
con la variación del CA en el envase,
modificándose substancialmente en los casos que
el CA aumenta de 35 a 65 para cada temperatura
estudiada.
32 Variación de ko con el CA
ko (1/días)
El parámetro ko cambia marcadamente con la
variación del CA. Mayor modificación se observó
al incrementarse de 35 a 65 a las tres
temperaturas.
33(No Transcript)
34Efecto de la Tde almacenamiento sobre ko
?0CA?5CA?20CA?35CA?65CA
35(No Transcript)
36Predicción del tiempo necesario para la reducción
de la conc. de etanol a la mitad de la incial.Se
utilizan gráficos de contorno para predecir la
variación de parámetros frente a diversas
variables.Se utiliza la ecuación Koa-b.T. E l
gráfico permite predecir el t necesario para que
la concentración de etanol caiga a la mitad del
valor inicial
Tpo(días)
T (ºC)
?0CA,?5CA,?20CA,?35CA?65CA
37Cálculo de la energía de activación La variación
de la constante cinética (ko) con T sigue
generalmente una variación tipo Arrhenius.
Donde T es la temperatura en ºK, EA es
la energía de activación (KJoule/mol). A es un
factor preexponencial y R es la constante de los
gases 8.31 (KJoule/ºK mol). Aplicando
logaritmos se obtiene
Representando ln (ko) en función de 1/T es
posible calcular la EA de la pendiente del
grafico correspondiente. La Figura muestra las
regresiones de Arrhenius para los diferentes
porcentajes de cámara de aire presente en el
recipiente. (EA) puede ser considerada como la
sensibilidad que presenta la constante de
decaimiento de la concentración de etanol (ko)
frente a los cambios térmicos.
Ln (ko)
?0CA,_5CA,?20CA,?35CA?65CA
38- Menores valores de EA se obtienen para el caso de
65 CA indicando que ko es influenciado por CA
que por T - Mayor EA se observa a 0CA sugiriendo que a 0CA
influyeT. Entre 5 y 35CA, valores intermedios
EA es posible que exista interacción entre T y
CA afecten (ko)
39Efecto de CA y temperatura sobre ko
- a 4 y 25ºC, donde (kCAj) corresponde al valor
(k0) a 0CA y (kCAi) al valor (k0) para
diferentes CA (5, 20, 35 y 65).
- (kTi) corresponde al valor (k0) a -10ºC T de lt
degradación. (kTj) corresponde al valor (k0) a 4
y 25ºC.
40Isobolograms
- Permiten analizar posibles interacciones entre
variables (CA y T)sobre el decaimiento del
etanol - Es posible expresar la contribución de cada
factor en combinación, con el objeto de estudiar
la evaluar efectos aditivo, sinergísta y
antagonista - Efecto de (ECA) y (ET) sobre (ko) (degradación de
etanol)
41- Geáficos muestran
- tres tipos de interaciones
- Aditivo cuando el efecto de uno de los factores
(CA o T) puede agregar al efecto causado por el
otro. - Sinergismo uno de los factores aumenta el efecto
del otro. - Antagonismo uno de los factores disminuye el
efecto causado por el otro.
42Predicción de la concentración inicial de etanol
- Predecir la Co de etanol en muestras almacenadas
a T y CA constante. - Si el tiempo en esas condiciones es conocido,
midiendo la concentración de etanol a un
específico tpo, es posible estimar la Co
43- ? CA/100
- T temperatura Kelvin
- t tiempo en días
- Cf concentración de etanol al tiempo (t),
- O y d constantes
- O 8.0 106 (g/L)5/3.día-1 d 10-4 (K-2).
- Vales en T (-10 a 25ºC), CA (0 y 54),
- Tiempo de 0 a 30 días
- Concentración etanol final entre 0 a 4.5 g/L
44- Ajuste de los datos experimentales (r20.9998) en
29 casos
- (?) Este estudio
- (?) Winek con preservador
- (?) Winek sin preservador
45Estudio de relación de áreas entre la señal
previa al estándar interno (amina de
putrefacción) y estándar interno isopropanol
(R).
R
- ( R ) en función del tiempo a las diferentes
condiciones estudiadas - 25ºC
- 4ºC
- -10ºC
46Estudio de la variación de etanol agregado a
muestras de sangre entera sin contenido de
etanol, bajo diferentes condiciones de
preservación.
Se eligió sangre entera por ser ésta la muestra
más habitual recibida en el laboratorio forense
47Efecto del almacenamiento a diferentes
temperaturas sobre muestras de sangre entera sin
agregado de alcohol y con 5 de NaF y 5CA.
48- Variacion de la concentración de alcohol agregada
a muestras de sangre entera con NaF y 5Ca - a)25ºC,
- b) 4ºC
- c) -10ºC
- Concentración inicial ? 0.84gt/L, ? 1.64 g/L, ?
2.70 g/L y ? 3.56 g/L
- Valores de ko 0.00407- 0.00159 1/día.
49- La cámara de aire en las muestras sanguíneas
remitidas para estudio de etanol se constituye en
el factor más importante de pérdida del alcohol. - La descomposición de sustancias orgánicas
complejas ejerce poca influencia en las pérdidas
o generación de alcohol, cuando son analizadas
por Cromatografía gaseosa instrumental. - La preservación de la sangre a bajas
temperaturas, NaF y con 5 de cámara de aire
ofrece muy buenas posibilidades de que el
resultado sea aceptablemente repetitivo en el
tiempo y hasta por lo menos 30 días posteriores a
la toma de muestra
50- El modelo cinético elaborado en base a los
resultados obtenidos se adaptan a lo consignado
por otros autores para la estimación de las
pérdidas ee etanol en muestras con pequeña cámara
de aire o sin ella.