Estabilidad, prdidas y generacin de alcohol etlico en muestras de sangre postmortem - PowerPoint PPT Presentation

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Estabilidad, prdidas y generacin de alcohol etlico en muestras de sangre postmortem

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... la sangre de personas vivas puede analizarse a n despu s de dos semanas sin ... mostraban p rdidas significativas reci n a partir de treinta d as (Winek, 1996) ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: Estabilidad, prdidas y generacin de alcohol etlico en muestras de sangre postmortem


1
  • Estabilidad, pérdidas y generación de alcohol
    etílico en muestras de sangre postmortem
  • Dra. Leda Giannuzzi
  • Cátedra de Toxicología y Química legal
  • Facultad de Ciencias Exactas, UNLP

2
Antecedentes
  • Los trabajos sobre pérdidas de etanol por
    fenómenos putrefactivos son controvertidos.
  • Coloccia y Argeri (1969) publicaron una
    experiencia donde observaron pérdidas totales de
    alcohol a los 15 días posteriores a la toma de
    muestra con una tasa diaria del 6.
  • No se mencionan datos sobre el estado del
    recipiente o muestra sanguínea en el momento de
    recepción y posterior resguardo como ser
    existencia de cámara de aire en el recipiente.

3
  • Otros señalan que las pérdidas de etanol no son
    relevantes durante su almacenamiento si las
    muestras son convenientemente extraídas y
    colocadas en recipientes adecuados y bien
    sellados.
  • Parson 2002, Sreerama y Hardin, 2003, Ferrari,
    2003

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  • El uso de preservantes como el fluoruro de sodio
    en sangre de individuos vivos no mejora mucho los
    resultados, más aún si la muestra fue tomada con
    jeringa estéril y mantenida a bajas temperaturas.
  • En estas condiciones la sangre de personas vivas
    puede analizarse aún después de dos semanas sin
    variaciones apreciables respecto de la
    alcoholemia que se hubiera obtenido en el primer
    día.
  • Winek y Paul, 1989.

5
  • Otros estudios en muestras de sangre entera y
    suero mantenidas por varias semanas a diferentes
    temperaturas, indicaron que las muestras
    resguardadas a mayor temperatura, mostraban
    pérdidas significativas recién a partir de
    treinta días (Winek, 1996)

6
  • La pérdida de alcohol posteriores al óbito y a la
    toma de muestra pueden inducir a conclusiones
    erróneas en los casos forenses analizados.

7
Producción de etanol post-mortem (ONeal y
Poklis, 1996)
  • Producción etanol post mortem (100 especies) in
    vivo e in vitro.
  • Candida albicans (boca y piel)
  • Glucosa, lactato, manitol, gal, mal, suc, lac
  • Hongos Mucor (materia orgánica y suelos)
  • Productos volátiles producidos por fenómenos post
    mortales n-propanol, butanol, feniletanol.

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  • 45 muestras de sangre y tejidos obtenidas de
    accidentes fatales en aviones el 95 de ellas
    contenían bacterias entéricas capaces de producir
    etanol (ampliación rDNA)

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NaF
  • 2 estudios concluyen que NaF no es efectivo en
    prevenir la formación etanol en sangre de origen
    microbiano con alta concentración de Candida
    albicans.
  • Bleme and Lakatua, 1973, Am J. Clin. Pathol.,
    700.
  • Chang, Kollman, 1989, J. Forensic Sci. 105.

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Efecto de la temperatura y NaF sobre la
producción de etanol en tejidos
  • Lewis, et. al, 2004, Forensic Sci. Intern. 17
  • Rinón y Músculo víctimas accidente aviación T 4
    y 25ºC
  • Con y sin 1 NaF
  • t- Butanol (standard interno)

11
(No Transcript)
12
  • Variación de Etanol en músculo (caso 9) durante
    el almacenamiento a 4 y 25ºC, con y sin NaF

sin
13
  • 1. Acetaldehido
  • 2. Metanol
  • 3. Etanol
  • 4 Acetona
  • 5. iso-propanol
  • 6. t- butanol
  • 7. n-propanol
  • 8. sec-butanol
  • 9. iso-butanol
  • 10. n-butanol
  • sugiere posible formación etanol por bacterias

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  • Se observa formación de etanol a 4 y 25C en
    tejidos (rinón, músculo) sin NaF
  • la velocidad de formación etanol fue menor a
    bajas temperatura, pero con el tiempo la
    producción de etanol en las muestras almacenadas
    a refrigeración son comparables a las de mayor
    temperatura.
  • La formación de etanol es virtualmente eliminado
    con 1 de NaF a 4 o 25ºC.
  • Se observa la formación de compuestos volátiles
    acetaldehido, n-propanol, sec-butanol,
    isopropanol, acetona, isobutanol.

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  • Comparación en la concentración de etanol en
    sangre de cavidad cardiaca derecha, izquierda y
    periférica (30 casos)
  • Grado de putrefacción, daño abdominal,
    regurgitación contenido gástrico en vías aéreas.
  • Pilissier Alicot et. al, 2005, Forensic Sci.
    International.

16
  • Etanol (g/L)

17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
  • Concentración de etanol en sangre cardíaca
    izquierda es significativamente mayor que en el
    lado derecho o sobre sangre periférica.
  • La diferencia en concentración no correlacionó
    con el grado de putrefacción, pero correlaciona
    con etanol en contenido gástrico.
  • La mayor diferencia se observa en sujetos con
    alta concentración en contenido gástrico y
    regurgitación (7, 8, 11, 12, 26 y 27).
  • Producción endógena de etanol (izquierdo) poco
    probable debido haber ausencia de propanol y
    etanol en humor vítreo es similar al obtenido en
    la cavidad derecho y sangre periférica.
  • Se acepta que la producción endógena generalmente
    no excede 0.3g/L si fue correctamente almacenada.

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  • En casos 22, 23, 25 mayor contenido de etanol en
    sangre cardíaca derecha que el izquierdo
    observandose también alto grado putrefacción y
    presencia de n- propanol debido a glucogenolisis
    hepática que libera glucosa en la cavidad derecha
    vía vena hepática y la vena cava inferior.
  • Redistribución del etanol desde el estomago 2
    mecanismos
  • a) gradiente de concentración desde estómago al
    corazón. Este fenómeno es fácil de entender por
    la posición anatómica del estómago y la parte
    izquierda del corazón
  • b) redistribución por vía pulmonar si el
    contenido gástrico es aspirado en la vía
    respiratoria. Redistribución vía vena pulmonar
    hacia la parte izquierda del corazón.

21
  • Casos en que la concentración de etanol en sangre
    periférica fue mayor que en corazón izquierdo y
    derecho (10, 25, 30) La autopsia revela
    mecanismos de resucitación sin éxito
  • sangre cardíaca derecha es menos afectada por la
    distribución debido a
  • 1) la sangre de este compartimiento no está
    directamente en contacto con el estómago
  • 2) si es aspirado el contenido gástrico en las
    vías aéreas, la difusión principalmente hacia la
    vena pulmonar y hacia la parte izquierda del
    corazón.
  • Los resultados presentan considerable valor
    práctico sugieren que es preferible sangre
    cardíaca del lado derecho mas que el izquierdo
    con el objeto de limitar tanto como sea posible
    la redistribución en particular si no hay sangre
    periférica.

22
Humor Vítreo
  • García Fernandez (1994) analizaron 30 muestras de
    humor vítreo
  • En doce se obtuvo correlación de la concentración
    de etanol en HV repecto sangre
  • etanolsangre/etanolhumor vítreo 0.7- 0.9 o
    invertirse
  • HV inmune a contaminación bacteriana o a
    transformavciones post-mortem

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  • Cinética de Degradación de Etanol en muestras de
    sangre Forenses

24
Objetivos
  • Estudiar la evolución del etanol en sangre en
    función del tiempo y evaluar fenómenos físicos en
    los recipientes donde son contenidos (cámara de
    aire) y la temperatura de conservación.
  • Analizar la influencia de compuestos originados
    en la sangre por descomposición de sustancias
    orgánicas sobre la concentración de alcohol,
    durante el almacenamiento de las muestras
    sanguíneas.
  • Racionalizar a través de un modelo teórico
    cinético la estimación de pérdidas en función de
    la cámara de aire del recipiente y la
    temperatura.

25
2. Materiales y métodos
  • Determinación de etanol en sangre individuos
    postmortem.
  • Espacio-cabeza 1 ml de sangre entera previamente
    homogeneizada.
  • Análisis por Cromatografía Gaseoso-FID columna
    de acero inoxidable (2 m de longitud, 3 mm de
    diámetro interno) empacada con 0.3 Carbowax
    1500-graphapack 60/80, isotérmica 100ºC.
  • Temperatura inicial 35C, 1 minuto y 10C/min de
    gradiente hasta 100C temperatura final siendo
    la temperatura de inyección y detector de 150C.
  • Diseño factorial de los ensayos de variación del
    contenido de etanol en muestras de sangre
    sometidas a diversas condiciones de preservación.

26
CA 0, 5, 20, 35 y 65 T almacenamiento 20ºC,
4ºC y 10ºC Diseño factorial (5 x 3), total 15
condiciones de ensayo. Estudio de la cinética de
degradación de etanol a tiempos 0, 3, 7, 15 y 30
días. Alcoholemia 0.5 y 4.30 g/L. Sangre entera
sin preservador Se estudió la generación de
sustancia de putrefacción determinadas por la
relación de áreas señal previa al Standard
interno (amina de putrefacción) y estándar
interno Isopropanol en las muestras de sangre
entera.
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3 . Controversia entre informes publicados
  • Coloccia y Argeri (1969) Pérdidas a tasa
    constante 6 y pérdida total en 17 días.
  • Charles Winek (1996) Aún a altas Temperaturas
    las pérdidas no son significativas en 35 d.
  • Sreerama Hardin (2003) Los envases no cerrados
    perfectamente provocan pérdidas de hasta 30.
  • Parsons (2002) La cámara de aire en recipientes
    provocaría pérdidas.
  • ONeal Poklis (1996) 58 Bacterias pueden
    producir etanol post toma de muestra.
  • Helander Beck (2004) EtG y EtS son buenos
    biomarcadores de consumo.

28
Resultados y discusión
Concentración de alcohol etílico (g/L) y relación
entre productos de putrefacción y estándar
interno en sangres enteras almacenadas en
distintas condiciones de temperatura y con
variables de cámara de aire (CA).
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Con el objeto de modelar el decaimiento del
etanol en función del tiempo, se ensayaron varias
cinéticas siendo la de pseudo-primer orden la que
presentó el mejor ajuste
Integrando ? dC/C ? -ko dt
ko constante aparente de decaimiento de pseudo
primer orden (1/día) C concentración de etanol
a tiempo t Co es la concentración inicial de
etanol (g/ L) t tiempo (días).
30
La velocidad de decaimiento del etanol aumenta en
función del incremento del porcentaje de CA y de
la temperatura.
  • ln(C/Co
  • Un buen ajuste de los datos experimentales se
    logró con la cinética propuesta

Cinética de decaimiento del etanol en muestras
de sangre a) 25?C, b) 4?C y c) 10?C, ?0CA, ?
5CA, ?20CA, ?35CA, ?65CA.
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Parámetros obtenidos del ajuste de la cinética
propuesta con datos experimentales. (R2
coeficiente de determinación).
Se observa que el parámetro ko varía marcadamente
con la variación del CA en el envase,
modificándose substancialmente en los casos que
el CA aumenta de 35 a 65 para cada temperatura
estudiada.
32


Variación de ko con el CA
ko (1/días)
El parámetro ko cambia marcadamente con la
variación del CA. Mayor modificación se observó
al incrementarse de 35 a 65 a las tres
temperaturas.
33
(No Transcript)
34
Efecto de la Tde almacenamiento sobre ko
?0CA?5CA?20CA?35CA?65CA
  • Ko
  • (1/día)

35
(No Transcript)
36
Predicción del tiempo necesario para la reducción
de la conc. de etanol a la mitad de la incial.Se
utilizan gráficos de contorno para predecir la
variación de parámetros frente a diversas
variables.Se utiliza la ecuación Koa-b.T. E l
gráfico permite predecir el t necesario para que
la concentración de etanol caiga a la mitad del
valor inicial
Tpo(días)
T (ºC)
?0CA,?5CA,?20CA,?35CA?65CA
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Cálculo de la energía de activación La variación
de la constante cinética (ko) con T sigue
generalmente una variación tipo Arrhenius.
Donde T es la temperatura en ºK, EA es
la energía de activación (KJoule/mol). A es un
factor preexponencial y R es la constante de los
gases 8.31 (KJoule/ºK mol). Aplicando
logaritmos se obtiene
Representando ln (ko) en función de 1/T es
posible calcular la EA de la pendiente del
grafico correspondiente. La Figura muestra las
regresiones de Arrhenius para los diferentes
porcentajes de cámara de aire presente en el
recipiente. (EA) puede ser considerada como la
sensibilidad que presenta la constante de
decaimiento de la concentración de etanol (ko)
frente a los cambios térmicos.
Ln (ko)
?0CA,_5CA,?20CA,?35CA?65CA
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  • Menores valores de EA se obtienen para el caso de
    65 CA indicando que ko es influenciado por CA
    que por T
  • Mayor EA se observa a 0CA sugiriendo que a 0CA
    influyeT. Entre 5 y 35CA, valores intermedios
    EA es posible que exista interacción entre T y
    CA afecten (ko)

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Efecto de CA y temperatura sobre ko
  • a 4 y 25ºC, donde (kCAj) corresponde al valor
    (k0) a 0CA y (kCAi) al valor (k0) para
    diferentes CA (5, 20, 35 y 65).
  • (kTi) corresponde al valor (k0) a -10ºC T de lt
    degradación. (kTj) corresponde al valor (k0) a 4
    y 25ºC.

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Isobolograms
  • Permiten analizar posibles interacciones entre
    variables (CA y T)sobre el decaimiento del
    etanol
  • Es posible expresar la contribución de cada
    factor en combinación, con el objeto de estudiar
    la evaluar efectos aditivo, sinergísta y
    antagonista
  • Efecto de (ECA) y (ET) sobre (ko) (degradación de
    etanol)

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  • Geáficos muestran
  • tres tipos de interaciones
  • Aditivo cuando el efecto de uno de los factores
    (CA o T) puede agregar al efecto causado por el
    otro.
  • Sinergismo uno de los factores aumenta el efecto
    del otro.
  • Antagonismo uno de los factores disminuye el
    efecto causado por el otro.

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Predicción de la concentración inicial de etanol
  • Predecir la Co de etanol en muestras almacenadas
    a T y CA constante.
  • Si el tiempo en esas condiciones es conocido,
    midiendo la concentración de etanol a un
    específico tpo, es posible estimar la Co

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  • ? CA/100
  • T temperatura Kelvin
  • t tiempo en días
  • Cf concentración de etanol al tiempo (t),
  • O y d constantes
  • O 8.0 106 (g/L)5/3.día-1 d 10-4 (K-2).
  • Vales en T (-10 a 25ºC), CA (0 y 54),
  • Tiempo de 0 a 30 días
  • Concentración etanol final entre 0 a 4.5 g/L

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  • Ajuste de los datos experimentales (r20.9998) en
    29 casos
  • (?) Este estudio
  • (?) Winek con preservador
  • (?) Winek sin preservador

45
Estudio de relación de áreas entre la señal
previa al estándar interno (amina de
putrefacción) y estándar interno isopropanol
(R).
R
  • ( R ) en función del tiempo a las diferentes
    condiciones estudiadas
  • 25ºC
  • 4ºC
  • -10ºC

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Estudio de la variación de etanol agregado a
muestras de sangre entera sin contenido de
etanol, bajo diferentes condiciones de
preservación.
Se eligió sangre entera por ser ésta la muestra
más habitual recibida en el laboratorio forense
47
Efecto del almacenamiento a diferentes
temperaturas sobre muestras de sangre entera sin
agregado de alcohol y con 5 de NaF y 5CA.
  • ? 25ºC, ? 4ºC, ?-10ºC

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  • Variacion de la concentración de alcohol agregada
    a muestras de sangre entera con NaF y 5Ca
  • a)25ºC,
  • b) 4ºC
  • c) -10ºC
  • Concentración inicial ? 0.84gt/L, ? 1.64 g/L, ?
    2.70 g/L y ? 3.56 g/L
  • Valores de ko 0.00407- 0.00159 1/día.

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  • La cámara de aire en las muestras sanguíneas
    remitidas para estudio de etanol se constituye en
    el factor más importante de pérdida del alcohol.
  • La descomposición de sustancias orgánicas
    complejas ejerce poca influencia en las pérdidas
    o generación de alcohol, cuando son analizadas
    por Cromatografía gaseosa instrumental.
  • La preservación de la sangre a bajas
    temperaturas, NaF y con 5 de cámara de aire
    ofrece muy buenas posibilidades de que el
    resultado sea aceptablemente repetitivo en el
    tiempo y hasta por lo menos 30 días posteriores a
    la toma de muestra

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  • El modelo cinético elaborado en base a los
    resultados obtenidos se adaptan a lo consignado
    por otros autores para la estimación de las
    pérdidas ee etanol en muestras con pequeña cámara
    de aire o sin ella.
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