CONSERVACIN DE CULTIVOS PARA LA BIOTECNOLOGA Y LA INDUSTRIA Dr' Claudio Voget Curso CABBIO, 2005

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CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PARALA BIOTECNOLOGÍA
Y LA INDUSTRIADr. Claudio VogetCurso CABBIO,
2005
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Porque y para que conservar los cultivos ?

• El cultivo (cepa microbiana o viral, linea
  celular, etc), es el elemento vital de la
  investigación o producción industrial
• Conservar implica mantener la viabilidad y
  propiedades genéticas del cultivo durante un
  determinado período de tiempo
• Consecuencias de una adecuada conservación
  estabilidad de las cepas de producción, pureza,
  reproducibilidad de la investigación. Reposición

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Métodos de conservación de cultivos

• 1. con crecimiento
• transferencia seriada
• 2. con metabolismo limitado
• agua destilada
• bajo aceite mineral (control por O2)
• 3. con metabolismo detenido
• 3.1 Congelamiento (crioconservación)
• 3.2 Deshidratación
• L-drying secado desde la fase líquida,
  silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de
  porcelana
• Liofilización (freeze-drying)

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CRIOCONSERVACIÓN

• Crioconservación es la conservación de material
  biológico a muy bajas temperaturas
• Rango -20 ºC a -196 ºC (nitrógeno líquido)
• El nitrógeno líquido es la temperatura práctica
  mas baja disponible. A la temperatura de
  equilibrio, la difusión molecular es
  extremadamente lenta y la probablilidad de que
  ocurran reacciones químicas es prácticamente nula

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CRIOINJURIA

• El proceso de congelamiento y descongelamiento
  produce cambios en las céluas que pueden resultar
  letales
• Los procesos perjudiciales son formación de
  cristales de hielo, exosmósis, aumento de la
  solubilidad de gases, deshidratación, aumento de
  la concentración de osmolitos, disminución del
  pH, alteraciones de la actividad enzimática,
  acumulación de metabolitos, incremento del
  contacto entre moléculas, ruptura de puentes de
  H, distorsión de macromoléculas, solidificación,
  pérdidad de la integridad de membranas, ruptura
  de emulsiones, etc
• La formación de hielo intra o extracelular es
  quizás el evento mas crítico de la crioinjuria.

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INJURIA POR CONGELAMIENTO
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CRIOPROTECCIÓN

• Control de la velocidad de enfriamiento
• Balance óptimo entre el efecto soluto y la
  formación e hielo. En la práctica es aceptable 10
  ºC/min. El descongelamiento debe
• ser lo mas rápido posible
• Incorporación de crioprotectores (CPs)
• CPs que permean la pared y membrana celular
• Me2SO ( Tp lt 30 min), Glicerol, Metanol
• Cps que permean la pared pero no la membrana
• mono y disacáridos, aminoácidos, polímeros de
  bajo PM(PEG 600-1000)
• Cps no permeantes
• Polímeros de alto PM proteínas, polisacáridos,
  PVP

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CRIOPROTECCIÓN

• El tipo de protección que ejerce el CPs depende
  de su permeabilidad
• Todos los CPs son altamente hidrofílicos
• CPs que permean totalmente ligan agua
  intracelular y reducen el efecto soluto
• CPs semipermeables forman entre la pared y la
  membrana celular una capa que proteje la célula
  del daño mecánico
• CPs no permeables se adorben en la superficie
  celular incrementando la viscosidad local lo cual
  manteniendo el hielo en forma amorfa evitando
  daño mecánico

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CONSERVACIÓN POR DESHIDRATACIÓN

• Este método implica la remoción de agua de las
  células (humedad final típica 0.06-5.0 de
  agua).
• La deshidratación puede llevarse a cabo desde la
  fase líquida (L-drying) o por sublimación desde
  el estado congelado (liofilización)
• Las pérdida de viabilidad durante la
  deshidratación es principalmente atribuida a
  alteraciones de la membrana celular.
• Las células deshidratadas son susceptibles al
  deterioro causado por oxígeno
• El deterioro de las células durante la
  deshidratación puede ser controlado por el
  agregado de aditivos. Algunos forman una matriz
  amorfa que dispersa los componentes tóxicos que
  la célula puede liberar durante el secado. Otro
  protectores interactúan con las membranas,
  estabilizando su estructura en el estado anhidro
• Los aditivos mas comunes son leche descremada,
  aminoácidos (glutamato) y azúcares (sacarosa,
  trealosa)

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Principios de la liofilización
muestra protectores en ampollas
vacío 30-60 militorrs
manifold
-70 ºC ? - 5 ºC
Bomba de vacío de aceite
trampa de agua
congelamiento etilenglicol hielo seco (- 40
ºC) etanol hielo seco (-70 ºC)
La muestra colocada en una ampolla estéril con un
plug de algodón, se congela entre - 40 ºC y -70
ºC. Una vez colocada la muestra en el manifold
del equipo se comienza con el vacío y se retira
el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5
ºC. A esta temperatura y con un vacío entre 30 y
60 militorrs, el secado es rápido. El tiempo es
variable y depende del volumen de muestra. Al
finalizar el proceso se sella la ampolla al vacío
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Consideraciones para la preservación de cultivos

• Debe definirse claramente el medio de cultivo y
  el tipo de agua (destilada, deionizada,
  corriente) empleados.
• Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado,
  líquido, sólido), el estado fisiológico de las
  células al momento de la cosecha (cultivos
  líquidos cosechados en fase estacionaria suelen
  ser mas resistentes que los de fase logarítmica),
  si se emplean células con medio ó lavadas.
  Determinar si el agente protector es tóxico.
• Definir condiciones de proceso concentración de
  células, tiempo de secado, agregado de
  protectores
• En procesos industriales la viabilidad no es lo
  único importante. La cepa debe mantener sus
  propiedades productivas. Desarrollar un test de
  producción o bioensayo
• Durante la recuperación de la especie conservada
  deben determinarse viabilidad, pureza,
  morfología, formación de producto, rasgos
  recombinates (plásmidos, resistencia a
  antibióticos, etc).

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Comparación de algunos métodos de preservación