UNIVERSITAT POLITCNICA DE CATALUNYA

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REDUCCIÓN ANAERÓBICA DE NITRATO POR OXIDACIÓN DE
PIRITA ESTUDIO DE LA CONTRIBUCIÓN DE
THIOBACILLUS DENITRIFICANS .
Clara Torrentó Aguerri Diciembre 2008 SEMINARIO
DEL GRUPO DE HIDROLOGÍA SUBTERRÁNEA
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Introducción (I)
Contaminación de las aguas subterráneas por
nitratos de origen agrícola Problema
medioambiental. Riesgo para la salud. Ejemplo
comarca de Osona
Comarca de OSONA (1263.8 km2 )

• Más de 1.000 granjas de cerdos
• 1.000.000 de cerdos
• Aplicación purín cerdo como fertilizante
• Más de 10.000 Tm de N por año
• Casi 80 pozos estudiados gt 50 mg/L NO3

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Introducción (II)

• Bioremediación natural de las aguas por
  desnitrificación
• Requisitos
• donador de electrones
• materia orgánica (desnitrificación heterótrofa)
• compuestos inorgánicos (desnitrificación
  autótrofa) Ej. pirita
• bacterias nitrato-reductoras
• condiciones anaeróbicas (no más de 2 mg/L DO)
• - condiciones ambientales favorables
  (temperatura, pH, otros nutrientes y elementos
  traza)

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Introducción (III)

• Estudio de la composición isotópica de las aguas
  subterráneas de Osona
• Atenuación natural
• Relacionada con la oxidación de pirita
• Otero et al (2007)

Grupo Mineralogía y Medio Ambiente de la
Universidad de Barcelona
Estrategias para acelerar procesos de atenuación
natural
Resulta imprescindible caracterizar las
reacciones de desnitrificación.

• Reducción anaeróbica de nitrato por oxidación de
  pirita en presencia la bacteria Thiobacillus
  denitrificans.
• Evaluar la eficacia y durabilidad de este proceso
  
• Cinética
• Mecanismos
• Implicación de la bacteria

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Cuestiones

• Comprobar que la reacción se produce.
• Se ha sugerido en estudios de campo pero
  experimentos fallidos (Devlin et al., 2000
  Haiijer et al., 2007).
• Mecanismo de la reacción. De qué manera
  cataliza la bacteria la reacción?
• Analogía con oxidación aeróbica por A.
  Ferrooxidans ? Mecanismo directo, indirecto o
  indirecto de contacto.
• Necesita la bacteria adherirse a la superficie
  del mineral? Contribución relativa de las
  bacterias adheridas y de las planctónicas
• Caracterizar la colonización
• Eficacia y durabilidad de la reacción.
• Experimentos de larga duración
• Velocidades de colonización, formación de
  biofilms. Factores ambientales (nitrato, oxígeno,
  otros nutrientes, pH, temperatura, salinidad,
  inhibidores).
• Velocidades de reducción de nitrato
• Productos generados, detención de la reacción
  Problemas (liberación de metales pesados,
  producción de sulfato, aumento dureza de las
  aguas, corrosión pozos)

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Cuestiones
Mecanismos. Analogía con oxidación aeróbica por
A. Ferrooxidans

• - Mecanismo directo la bacteria se adhiere a la
  superficie del mineral y lo oxida mediante
  reacción biológica (enzimática. Requiere contacto
  físico entre bacteria y mineral.
• Mecanismo indirecto bacterias planctónicas
  oxidan Fe2 en solución a Fe3, que oxida el
  mineral electroquímicamente.
• Mecanismo indirecto de contacto (Sand et al.,
  2001 Crundwell, 2003) bacterias adheridas a la
  superficie del mineral oxidan Fe2 dentro de una
  capa de EPS alrededor de la bacteria y el Fe3
  generado oxida el mineral. La bacteria juega un
  papel catalítico importante oxidando el Fe2
  (regenerando el oxidante). Y también concentra el
  Fe3 en la capa de EPS, dentro de la cual tienen
  lugar los procesos químicos.
• Es el modelo más aceptado, aunque se sigue
  discutiendo la importancia de la adhesión o el
  papel de bacterias planctónicas.

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Experimentos laboratorio

• Dos tipos de experimentos tipo batch con cultivo
  puro de T. denitrificans
• Con pirita en polvo
• Comprobar que la reacción se produce, evaluar el
  efecto de diversos factores (nitrato, pH,
  nutrientes) Pirita en polvo ? superficie
  reactiva alta, permite ver cambios en la química.
• Con fragmentos de pirita
• Estudiar la colonización de la superficie del
  mineral. Discernir el mecanismo de la reacción,
  la importancia de la adhesión. Fragmentos de
  pirita con superficies lisas y regulares
  (superficie reactiva baja, imposible ver cambios
  en la composición química de la solución)

Departamento de Microbiología de la Universidad
de Barcelona
Department of Biological Sciences, University of
Southern California
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Condiciones experimentales

• Cultivo de la bacteria en medio específico
  (tiosulfato). Medio de cultivo mejorado con
  elementos traza y vitaminas (soluciones stock de
  Widdel and Bak, 1992, siguiendo Beller, 2005)
• Aislamiento y lavado con solución de entrada
  (sin tiosulfato, pero manteniendo compuestos
  esenciales para metabolismo bacterias)
• solución de entrada pH en torno a 7
• atmósfera anóxica N2CO2, 91 en volumen
• esterilización de todo el material, mineral y
  soluciones

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1. EXPERIMENTOS BATCH CON PIRITA EN POLVO

• A) Experimentos con pirita. Solución medio
  modificado. Variando la concentración de NO3 y la
  relación sólidolíquido
• B) Blancos. Igual pero sin bacterias
• C) Controles. Solución medio de cultivo. Con o
  sin pirita.

• Muestras líquidas
• pH
• aniones (HPLC)
• NH4
• FeII/FeIII (espectrofotómetro)
• cationes (ICP)

• Muestras sólidas (al final)
• SEM

pirita 50-100 mm
10
25 mL medium (20 mM NO3, 20 mM S2O3, PO4, K,
NH4) Without py 1 mL cell solution (108 cells/mL)
CONTROLES (sin pirita)
NO3/SO4 0.8
Reduction 100
11
25 mL medium (20 mM NO3, 20 mM S2O3, PO4, K,
NH4) 5 g py (15) 1 mL cell solution (108
cells/mL)
CONTROLES (con pirita)
4.6x10-10 mol m2 s-1 log -9.3
Reduction 100
12
25 mL (4 mM NO3, PO4, K, NH4) 5 g py
(15) Without bacteria
BLANCOS
6.5x10-10 mol m2 s-1 log -9.2
No NO3 reduction
13
25 mL (21 mM NO3, without S2O3, PO4, K, NH4) 5 g
py (15) 1 mL cell solution (108 cells/mL)
EXPERIMENTOS CON PIRITA (I)
8.5x10-10 mol m2 s-1 log -9.1
Max NO3 reduced 2.5 mM ? 3.1 mM SO4
Reduction max. 20
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25 mL (4 mM NO3, without S2O3, PO4, K, NH4) 5 g
py (15) 1 mL cell solution (108 cells/mL)
EXPERIMENTOS CON PIRITA (II)
7.5x10-10 mol m2 s-1 log -9.1
Max NO3 reduced 1.3 mM ? 1.7 mM SO4
Reduction max. 25
15
25 mL (2.5 mM NO3, without S2O3, PO4, K, NH4) 5
g py (15) 1 mL cell solution (108 cells/mL)
EXPERIMENTOS CON PIRITA (III)
5.1x10-10 mol m2 s-1 log -9.3
Max NO3 reduced 0.7 mM ? 0.9 mM SO4
Reduction max. 30
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2. EXPERIMENTOS BATCH CON FRAGMENTOS DE PIRITA
3 py slabs 48 mL modified medium 2 mL
culture Blanks 3 py slabs 50 mL modified
medium
Py slabs ? blocks (aprox. 3x1x1 mm) of py thin
sections

• Py slabs once a week using sterilized forceps
• SEM
• Fluorescent microscope cell counts on surface

Pyrite slabs (aprox. 3x1x1 mm)
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SEM EPM FRAGMENTOS PIRITA (I)
Inicial
18
SEM EPM FRAGMENTOS PIRITA (II)
1 semana
19
SEM EPM FRAGMENTOS PIRITA (III)
2 semanas
20
SEM EPM FRAGMENTOS PIRITA (IV)
3 semanas
21
SEM EPM FRAGMENTOS PIRITA (VI)
4 semanas
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Cálculo bacterias adheridas a la superficie del
mineral (I)
Microscopio de fluorescencia ? análisis de
imágenes (promedio entre 10 y 20 imágenes)
superficie aparente cubierta por bacterias
nb nº pixels correspondientes a
bacterias nt nº pixels total
Sabiendo que la superficie relativa que cubre una
bacteria es aprox. 1 mm2 ? bacterias / mm2
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Cálculo bacterias adheridas a la superficie del
mineral (II)
Bacterias cubren como máximo un 0.05 de la
superficie disponible
bacterias adheridas a la superficie respecto
al total de bacterias lt 0.01 ?
4 x 101 bacterias mm-2 h-1
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Conclusiones y trabajo futuro

• La reacción es posible en presencia de esta
  bacteria. Cierta idea sobre reducción máxima
  (30). Si se deja más tiempo seguirá aumentando?
  Influencia del pH.
• Nuevos experimentos búsqueda condiciones idóneas
  para máxima reducción.

• Colonización muy lenta. Microcolonias, pero no
  llega a formarse biofilm. Más tiempo?
• Colonización menor y más lenta que en el caso de
  A. ferrooxidans
• Porcentaje de bacterias que se adhieren respecto
  al número total es muy pequeño (inferior al
  0.01?). Importancia de bacterias planctónicas y
  adheridas?
• Experimentos de mayor duración. Aumento de la
  superficie ocupada por bacterias? Distribución
  bacterias, biofilm

• Experimentos de flujo continuo para evaluar
  eficacia y durabilidad del proceso, obtención
  velocidades de reducción de nitrato,
  caracterización de los productos de la reacción

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Referencias
Beller, H.R. (2005) Anaerobic,
nitrate-dependent oxidation of U(IV) oxide
minerals by the chemolithoautotrophic bacterium
Thiobacillus denitrificans. Applied and
Environmental Microbiology 71 2170-2174.
Devlin, J.F., Eedy, R., and Butler, B.J. (2000)
The effects of electron donor and granular iron
on nitrate transformation rates in sediments from
a municipal water supply aquifer. Journal of
Contaminant Hydrology 46 81. Edwards,
K.J., Schrenk, M.O., Hamers, R., and Banfield,
J.F. (1998) Microbial oxidation of pyrite
Experiments using microorganisms from an extreme
acidic environment. American Mineralogist 83
1444-1453. Haaijer, S.C.M., Lamers, L.P.M.,
Smolders, A.J.P., Jetten, M.S.M., and Op de Camp,
H.J.M. (2007) Iron sulfide and pyrite as
potential electron donors for microbial nitrate
reduction in freshwater wetlands. Geomicrobiology
Journal 24 391-401. Otero, N., Menció, A.,
Torrentó, C., Soler, A., and Mas-Pla, J. (2007)
Estudio multi-isotópico de la atenuación natural
de la contaminación por nitratos en un sistema
acuífero regional Plana de Vic (Osona, NE
España). Geogaceta 41 155-158. Pisapia,
C., Humbert, B., Chaussidon, M., and Mustin, C.
(2008) Perforative corrosion of pyrite enhanced
by direct attachment of Acidithiobacillus
ferrooxidans. Geomicrobiology Journal 25
261-273. Sand, W., Gehrke, T., Jozsa,
P.-G., and Schippers, A. (2001) (Bio)chemistry of
bacterial leaching - direct vs. indirect
bioleaching. Hydrometallurgy 59 159-175.
Widdel, F., and Bak, F. (1992) Gram-negative
mesophilic sulfate-reducing bacteria. In The
Prokaryotes. A. Balows, H.G.T., M. Dworkin, W.
Harper and K.-H. Schleifer (ed). New York
Springer Verlag, pp. 3352-3378.
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REDUCCIÓN ANAERÓBICA DE NITRATO POR OXIDACIÓN DE
PIRITA ESTUDIO DE LA CONTRIBUCIÓN DE
THIOBACILLUS DENITRIFICANS .
Clara Torrentó Aguerri Diciembre 2008 SEMINARIO
DEL GRUPO DE HIDROLOGÍA SUBTERRÁNEA