Développement d’un bactériophage rapporteur bioluminescent synthétique

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(No Transcript)
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Introduction

• Avec laugmentation de la pollution
  environnementale le risque de contaminations
  alimentaires préoccupe de plus en plus la
  communauté vue les maladies sévères quelle
  pourrait engendrer.
• Doù limportance de développer des méthodes
  pour une détection rapide de toute sorte de
  contamination.

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À savoir

• Salmonella enterica serovar Typhimurium
• Bactérie gram (-)
• responsable des symptômes qui vont de la diarrhée
  légère à la gastro-entérite aiguë chez lhomme et
  cause la fièvre typhoïde chez les animaux.
• 93.8 millions des cas de gastro-entérite dans le
  monde sont causées par une infection de
  Salmonella avec 155,000 mort chaque année dont
  80.3 millions sont victime daliments contaminé
  par la bactérie en question.

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Méthodes classique de détection de contamination
La présence DATP, dADN non cible, protéines et
autre particule forme une barrière ne permettent
pas à ces méthodes de détecter les cellules cible.
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Méthode basée sur lutilisation dun
bactériophage rapporteur

• Principe insertion dun gène rapporteur dans le
  génome du bactériophage spécifique à la bactérie
  quon veut détecté.
• Avantages
• Spécifique à la bactérie cible
• Capacité de distinguer entre bactérie vivante et
  morte
• Production de masse facile
• Moins couteux
• Longue durée de vie
• Détection rapide

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Idée générale
SPC32H CDABE
LUX CDABE
SPC32H
Bactériophage de Salmonella Typhimurium
Opéron bactérien
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Capacité de clonage limitée gt on élimine les
gènes non essentiels et on les remplaces avec
lopéron bactérien
Opéron bactérien de 6 Kb
Substrat de luciférase
Enzyme qui ce trouve dans les cellules des
organismes bioluminescents et qui catalyse
loxydation de la luciférine ( FMNH2 Aldéhyde
aliphatique) en oxyluciférine avec émission de
photons .
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Les gènes Lux

• Gènes responsables des réactions qui entrainent
  lémission de lumière
• Ils sont utilisé dans la construction de bio
  rapporteurs
• Émettent une lumière bleu-vert a 490 nm
• Il existe 5 gènes lux A, B, C, D et E
  
• Les différentes combinaisons
  entre ces gènes génère différents bio
  rapporteurs.

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Matériels
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Milieux et conditions de cultures

• 37 C Aérobie
• Milieu LB ( bouillon agar 1.5 )
• Ampicilline (Ap) 50 µg/ml
• Kanamycine (Km) 50 µg/ml
• Chloramphénicol (Cm) 25 µg/ml
• L()- arabinose 100 Mm
• Mitomycine C ( MMC ) 1.0 µg/ml
• Saccharose (20 )
• N-décanal (1 ) n- décylaldéhyde
• (substrat exogène pour LuxAB)

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Souche bactérienne, bactériophage et plasmides

• Souche SR5100 ?LT2gtrABC1 (32H) SR5003
  lysogenized by SPC32H
• ( LT2 souche sauvage de salmonella hôte pour le
  phage SPC32H )
• E. coli S17-1 ?pir
• SPC32H phage qui infecte Salmonella Typhimurium
  
• Plasmides
• Red Helper pKD46
• pKD13
• pCP20
• pCE70
• PBBR lux
• plasmide suicidaire PDS132

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Méthodes
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1 One-step inactivation method of chromosomal
gene

• Méthode de Datsenko et wanner.
• Principe
• Remplacer par recombinaison homologue, une
  séquence chromosomique par un gène de résistance
  à laide damorces portant des extensions
  homologues au gènes cibles.

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Produit PCR constitué par le gène de résistance à
la kanamycine entouré par des séquences FRT et
dont les extrémités comprennent des séquences
homologue au gène à éliminer gt porté par pKD13
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(No Transcript)
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2- Induction

• Pousser la bactérie lysogène à libérer une grande
  quantité de phages ( que la quantité quelle
  libère normalement )
• La portion de bactéries qui subissent un cycle
  lytique devient considérable.
• Agent inducteur Mitomycine C.

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3- Luminométrie

• Appareil
• Luminomètre
• Fonction
• Mesurer une intensité lumineuse
• ( bioluminescence et ATP métrie )
• Il comprend
• Un Détecteur de lumière qui compte les photons
• Un Système électronique converti et affiche la
  mesure de photons en RLU ( relative luminescence
  units )
• Un tube photomultiplicateur
• Une chambre de mesure
• Un injecteur de réactifs.

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Partie expérimentale
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I- La construction du Phage
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Capacité de la tête du phage est limitée
Solution ??????????
Diminution du pouvoir infectieux du phage
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Choix et délétion des gènes non essentiels
Conversion lysogénique le gène du phage
sintègre dans les chromosomes de la bactérie et
la mettent en état latent ( lytique ? lysogénique
) et la rendant plus virulente ex.
modification de lantigène O de salmonella qui
est reconnu par le Sys. immunitaire

• Les gènes impliquées dans la conversion
  lysogénique
• Antigène-O Acétylase ( oac )
• Glucose translocase ( gtrA)
• Le gène (Int) séquence codante pour lintégrase .
• ( on a gardé une partie du cote 5 terminal
  importante pour lexcision )
• Le site situé directement après lopéron CPS.

• Elimination par la méthode one-step en utilisant
  
• le plasmide pKD13 portant le gène de résistance
  a la kanamycine
• le plasmide pCP20 portant le gène de FLP
  recombinase
• ( mais pas pour le site situé
  après lopéron CPS )

Rôle dans l intégration du génome du phage dans
le chromosomes de l hôte et son excision
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Insertion du gène Lux

• I- Choix du site cible
• Directement après le Promoteur de CPS
• Pourquoi ?
• Région transcrite de manière efficace
• Preuve ?
• On a inséré dans cette région le gène lacz sans
  promoteur apporté par le plasmide pCE70 et sous
  traitement par MMC on a induit un cycle lytique.
  Après test de la ß-Galactosidase on a prouvé que
  ce promoteur (Pcps) est largement transcrit par
  suite cette région serait la plus convenable.

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Insertion du gène Lux

• II- Préparation à linsertion
• Le plasmide pBBRlux porte les gènes Lux ( AB ou
  CDABE)
• Amplification du gène par PCR ( fragment de
  pBRlux avec le gène dans son centre)
• Clonage du fragment amplifié dans le plasmide
  suicidaire pDS132
• Lysogénisation d E. coli S17-1 ?pir par le
  phage SPC32 H
  ( contenant le gène de résistance a la
  kanamycine au niveau du site cible ( one-step
  method) )
• Transformation DEcoli par pDSluxAB ou
  pDS-LuxCDABE
• Conjugaison entre E. Coli transformée et
  lysogénisée .

• Plasmide suicidaire pDS132
• plasmide non réplicatif,
• aide a l intégration du fragment dADN.
• disparait au cours des générations
• gène dont lexpression peut être létale (ici
  sacB)
• gène de résistance aux antibiotiques (
  chloramphénicol  cm  )

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Insertion du gène Lux

• III- Intégration au site cible

SPC32H KmR
Gène sacB Gène de la Bacillus Subtilis confère
une sensibilité au saccharose au bac
gram(-) Cest le gène suicidaire de pDS132
KmR et CmS
pDS-Lux
Première recombinaison homologue
KmR et CmR
Par compétition du saccharose (présent à 20)
Deuxième recombinaison homologue
SPC32HLux Insertion validée par séquençage
KmS et CmS
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II- Contrôle de lefficacité du Phage modifié
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1- Contrôle de laffinité du phage rapporteur

• But
• Savoir si la modification génétique de SPC32H a
  altérée son affinité et son habilité de lyser la
  bactérie Salmonella Typhimurium.
• Méthode
• Test de concurrence bactériennes mesurée par D.O.
• Échantillons testés
• Solution de phages SPC32H-ABi culture
  Salmonella
• Solution de phages SPC32H-AB culture
  Salmonella
• Solution de phages SPC32H-CDABE culture
  Salmonella
• Solution de phages SPC32H culture Salmonella
• Solution de contrôle négatif Tampon SM
  culture Salmonella

Phage contenant le gène luxAB et le gène (Int)
codant pour lintégrase
Souche sauvage du phage non modifié
Tampon utilisé pour dilution et stockage de
bactériophages
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• Résultats

Cette Intervalle peut être due à 1-
Complication dans lassemblement du phage due à
la surexpression du gène luxCDABE à partir du
promoteur CPS. 2- Problèmes dencapsidation du
phage causés par laugmentation de la taille du
génome du phage de 3kb gt souche sauvage.
Ces résultats indiquent que laffinité et le
pouvoir infectieux du phage SP32H nont pas étés
altérer par la modification de son génome.
Cycle Lysogénique présence de (Int )
L introduction du gène lux AB na pas altérée le
pouvoir infectieux de la souche sauvage
Après 3 h daction le taux de Salmonella inhibée
est devenu à peut-près égale pour les deux phages.
Début de la lyse de par SPC32H-AB
Début de la lyse par SPC32H-CDABE
SPC32H tolère linsertion de fragment de 2kb
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2- Validation de la production de bioluminescence
par le phage génétiquement modifié

• But
• Mettre en évidence la production de
  bioluminescence par les cellules infectées par le
  phage modifié contenant les gènes lux .
• Méthode
• Mesure luminométrique

Il faut ajouter avant la mesure, 4 µL
n-décanal(1) pour les phages contenant le gène
luxAB sans lux CDE
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• Résultats

SPC32H-CDABE présente une bioluminescence
signifiante et sans lyse immédiate
Pourquoi SPC32H-ABi-2 nentre pas en cycle
lytique (T100) comme SPC32H-AB ??
Tout les phages ont présentés des niveaux
comparable de luminescences
SPC32H-ABi-2 SPC32H-ABi-1 - Le gène (Int)
L intégrase est nécessaire pour la lysogénie
Mais il y a aussi les gènes répresseurs qui
inhibent toute expression de gènes lytiques . L
élimination du gène Int dans SPC32H-ABi-2 ne
conduira ni a un cycle lytique et ni un cycle
lysogénique pour un certain temps la cellule
reste en état appelé pseudolysogénique .
SPC32H-ABi-2 et SPC32H-ABi-1 procurent le même
niveau de bioluminescence
labsence d intégrase naboutit pas directement
une activité lytique
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3- Contrôle de détection spécifique de Salmonella
vivante

• Test de laffinité
• But
• Mesurer la quantité de salmonella d après l
  intensité de l émission lumineuse
• Procédure
• Dilution en série de cultures de salmonella 10X
• Infection par SPC32H-CDABE ( 108 PFU/mL )
• Mesure de la bioluminescence émise pour 2 h
  dinfection
• ( pour capter le maximum de signal
  lumineux même pour les plus petites concentration
  de salmonella )
• Test de spécificité
• Dans les aliments et dans lenvironnement
  Salmonella se trouve avec beaucoup dautre
  bactéries pour cela la méthode de détection
  utilisée ne doit pas être influencé par la
  présence dautres bactéries
• On a mélangé la souche MG1655 d E. Coli avec le
  phage SPC32H-CDABE et on a mesuré la
  bioluminescence.
• On a mélangé la souche MG1655 avec Salmonella et
  le phage et on a mesuré la bioluminescence

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• Résultats

Test de laffinité
Test de spécificité
Il y a corrélation entre la valeur RLU et le
nombre de bactéries énuméré par comptage directe
on a put détecter 20 CFU/ml de salmonella
Aucune émission de bioluminescence
Linfection avec SPC32H-CDABE permet de savoir le
nombre de salmonella grâce aux signaux
bioluminescent
Niveau de bioluminescence égal a celui qui est
émis en présence de salmonella seul
L intensité de détection nest pas altérée par
présence dautre bactérie non spécifique à
SPC32H-CDABE
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3- Contrôle de détection spécifique de Salmonella
vivante

• Test de l habilitée de SPC32H-CDABE de détecter
  SEULMENT les Salmonella vivante
• Capacité de distinguer entre bactérie vivante et
  morte est une des objectifs de lutilisation de
  la Méthode basée sur lutilisation dun
  bactériophage rapporteur.
• Procédure
• Culture de Salmonella de 105 UFC/ml
• La moitié de cette quantité est traitée 30 min
  avec de l éthanol 70 (v/v)
• Récupération des bactéries et resuspension dans
  un bouillon LB
• Mélange des cellules morte avec les cellule
  vivante ensemble dans des ratios différents ( 100
  , 10, 1, 0.1 et 0 de cellules vivante ).
• Infection de chaque Mélange avec SPC32H-CDABE (
  108 PFU/ml)
• Mesures luminométrique.

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• Résultats

Pas de cellules vivantes pas de signal lumineux
SPC32H-CDABE détecte SEULMENT les Salmonella
vivantes ce qui prévient les faux-positif obtenus
par les tests classiques dues à aucune
distinction entre cellule morte et vivante
Échantillons contrôles
L intensité du signal lumineux augmente avec
laugmentation du taux des cellules vivante dans
la solution.
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III- Applications sur les aliments
Laitue, Tranche de porc, Lait
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1- Contaminations artificielles des échantillons
alimentaires
Consommée frais et sans cuisson
Viande de porc, poulet et bœuf ont un effet
inhibiteur sur la détection des éléments
pathogènes par PCR

• A- préparation de linoculum pour la
  contamination artificielle
• culture de Salmonella dans 3 ml de bouillon LB à
  37 C pour obtenir une valeur de D.O600 0.5
  4 x 107 CFU/ml
• Dilutions en séries 10 X ( de 10 a 1 x10 6
  CFU/ml ) dans bouillon LB
• Quantification de la concentration par étalement
  sur gélose LB ou XLD
• B- Contamination des échantillons

Un des inconvénients des autres phages portant
les gènes lux cest linhibition du signal
lumineux dans les échantillons turbide (trouble -
laiteux) ? on veut tester la capacité de notre
Phage rapporteur
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Résultats
L intensité du signal est moins important que
celui des autres échantillons mais continue a
démontré une allure dose- dépendante et linéaire
en corrélation avec le nombre de bactérie
Niveau de bioluminescence important avec une
intensité dépendante du nombre des salmonella
même comparable au niveau du signal émis de l
échantillon standard ne contenant que salmonella
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Conclusions
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La quantité qui cause une maladie est 107
cellule chez une personne normal
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Merci pour votre attention