ETUDE PAR CYTOMETRIE EN FLUX DU DOUBLE MARQUAGE ADN-KI67 DE TUMEURS CEREBRALES

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ETUDE PAR CYTOMETRIE EN FLUX DU DOUBLE MARQUAGE
ADN-KI67 DE TUMEURS CEREBRALES

• Maîtrise de biologie cellulaire et physiologie

Centre Paul Papin Laboratoire de cytométrie en
flux
Par Alexis Dereeper
Maître de stage Mme CHASSEVENT
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Introduction

• - La cytométrie en flux mesure
• Contenu en ADN ou ADN-ploïdie des cellules
  tumorales
• de cellules tumorales en phase S (S)

• Autre méthode dévaluation du caractère
  prolifératif dune tumeur
• quantification des cellules impliquées dans le
  cycle cellulaire par marquage dune protéine
  spécifique des cellules en cycle la protéine
  Ki67
• Double marquage ADN-Ki67

- Application aux tumeurs cérébrales
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OBJECTIFS 1 ) Estimation de la prolifération
S Ki67 pos2 ) ADN-ploïdie
S Ki67 positif
Corrélations?
Grade histologique de la tumeur
Corrélations?
Survie des patients
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Matériels et méthodes
1 ) Patients et tumeurs
- Analyse de fragments tumoraux de 54 patients.
Simple marquage dADN Double marquage ADN-Ki67
Étude de faisabilité 10 5
Poitiers 31 14
Angers ( PHRC ) 13 10
total 54 29
PHRC Projet Hospitalier de Recherche Clinique

• - Parmi ces 54 fragments tumoraux
• 49 conservés congelés dans lazote liquide
• 5 provenaient de coupes de tumeurs incluses en
  paraffine

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2 ) Tumeurs cérébrales et grade histologique

• - Proliférations de cellules tumorales dans le
  cerveau ou la moelle épinière

• - Tumeurs gliales 4 catégories selon le degré
  de malignité
• Astrocytome pilocytique grade 1 de lOMS
• Astrocytome et oligodendrogliome grade 2
• Astrocytome et oligodendrogliome anaplasiques
  grade 3
• Glioblastome (multiforme) grade 4

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- Antigène reconnu par lanticorps MIB1
utilisation pour marquer spécifiquement les
cellules en cycle- Contrôles de marquage
négatifs lymphocytes quiescentspositifs
lignée cellulaire cultivée in-vitro en phase
exponentielle de croissance
3 ) La protéine Ki67
- Protéine nucléaire exprimée par la cellule
lorsquelle est entrée dans le cycle
cellulaire Marqueur de prolifération
cellulaireSon expression augmente
progressivement au cours des phases S, G2 puis M
du cycle.
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• 4 ) Cytométrie en flux
• - Principe
• Cellules en suspension marquées par un agent
  intercalant de lADN iodure de propidium

Fluorescence rouge directement proportionnelle à
la quantité de fluorochrome fixé, donc à la
quantité dADN dans chaque cellule

• Lanalyse par le cytomètre aboutit à un
  histogramme dADN
• Un pic correspondant aux cellules en phase G1 ou
  G0
• Un pic G2-M
• Un rectangle entre les 2 pics correspondant aux
  cellules en phase S

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Différents types dADN-ploïdie
Tumeur diploïde, aneuploïde, tétraploïde,
multiploïde.
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Couplage du marquage de lADN à un immunomarquage
indirect de lantigène Ki67, en utilisant des
anticorps MIB1 couplés au FITC.
Fluorescence verte permettant dapprécier la
proportion de cellules en cycle
Anticorps murin anti-Ki67 (MIB1)
FITC
Anticorps de chèvre anti-souris
Antigène Ki67
Distinction des cellules Ki67 positives et
analyse de leur cycle cellulaire
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Résultats
1 ) Analyse dun double marquage ADN-Ki67
Fluorescence verte
Ki67 positives 18.1
G2-M
G1
Seuil positivité
S
Fluorescence rouge
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2 ) Comparaison des résultats du simple marquage
dADN et du double marquage ADN-Ki67
Vérification que les données recueillies par la
technique de double marquage sont les mêmes que
celle de la technique de référence. Parmi les 54
fragments tumoraux étudiés, 29 ont pu être
analysés en double marquage les résultats de
ploïdie et S ne sont pas différents entre les 2
techniques.
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3 ) Étude des corrélations

• État de prolifération Ki67 positif tend à
  augmenter avec le S (faible corrélation r0.45)

• Corrélation avec le grade le pourcentage de
  cellules en phase S ainsi que la proportion de
  cellules marquées par le Ki67 augmente de façon
  significative avec le grade histologique de la
  tumeur.

p 0.003
p 0.04
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- Corrélations avec la ploïdie

• Le pourcentage de cellules Ki67 positives est
  supérieur chez les patients atteints de tumeurs
  aneuploïdes (p0.01).

• De même, le S moyen est supérieur pour les
  patients ayant un contenu anormal en ADN.

Aneuploïdes Smoyen 9.6
Diploïdes Smoyen 4.1
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• Ploïdie / grade histologique
• Le daneuploïdie semble augmenter avec le grade
  histologique de la tumeur.

Grade 1 et 2 Grade 3 Grade 4
diploïde 7 9 15
aneuploïde 1 5 14
aneuploïdie 12.5 39.7 48.3
Test du Chi2 p 0.18
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Conclusion
- Mêmes résultats dADN-ploïdie et fraction de
cellules en phase S quavec le simple marquage
dADN (qualité des histogrammes dADN inchangée)
Information supplémentaire venant renforcer la
caractérisation des tumeurs
- Paramètres étudiés Ploïdie
S
Ki67 pos
Corrélations avec la survie ?
- Bien que S et Ki67pos ne soient pas en
parfaite corrélation, ils évoluent de façon
proportionnelle
2 techniques complémentaires dans lestimation du
caractère prolifératif de la tumeur
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Bibliographie
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