Genetica e genomica - Vol. III - Cap. 19 - Manuale per il docente

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(No Transcript)
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19.1 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Tabella 19.1 Esempi di enzimi di restrizione con
indicazioni relative allorganismo di origine e
alla sequenza di riconoscimento (la linea nera
indica lasse di simmetria binaria mentre le
frecce contraddistinguono i siti di taglio).
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19.1 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Figura 19.1 Meccanismo di azione di EcoRI
(endonucleasi sticky end) (A) e Smal (enzima
blunt end) (B).
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19.1 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Figura 19.2 Produzione di molecole di DNA
ricombinante.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
PLASMIDI
Figura 19.3 Mappa di un plasmide modello usato
come vettore di clonaggio composto di sequenza
di origine della replicazione (ori), gene per la
resistenza allampicillina (ampR), gene per la
ß-galattosidasi (lacZ) e regione con siti unici
di restrizione (polylinker).
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
PLASMIDI
Figura 19.4 Saggio colorimetrico per il
riconoscimento delle colonie batteriche ottenute
da cellule contenenti il plasmide con linserto
di DNA esogeno.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
PLASMIDI
Figura 19.5 Mappa di un plasmide usato per
trascrivere RNA e per clonare DNA dei prodotti di
PCR.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI
Figura 19.6 Vettore di clonaggio derivato dal
batteriofago ?.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI
Figura 19.7 Clonaggio di DNA esogeno in vettori
di inserzione e di sostituzione.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI
Figura 19.8 Vettore di clonaggio cosmidico.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI
BATTERI (BAC)
Figura 19.9 Vettore di clonaggio YAC
circolarizzato unendo i telomeri con una
regione di riempimento e linearizzato dopo
restrizione con BamHI al fine di rimuovere la
regione di riempimento i siti unici di
restrizione del polylinker possono essere
impiegati per inserire frammenti di DNA esogeno.
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI
BATTERI (BAC)
Figura 19.10 Colonie di lievito contenenti
vettori di clonaggio ricombinanti (bianche) e
senza inserto di DNA esogeno (rosse).
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19.2 VETTORI DI CLONAGGIO
CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI
BATTERI (BAC)
Figura 19.11 Organizzazione di un vettore BAC.
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19.3 GENOTECHE LIBRERIE DI DNA GENOMICO
(gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)
Figura 19.12 Costruzione di una libreria genomica.
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19.3 GENOTECHE LIBRERIE DI DNA GENOMICO
(gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)
Figura 19.13 Digestione totale e parziale di DNA
genomico.
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19.3 GENOTECHE LIBRERIE DI DNA GENOMICO
(gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)
Figura 19.14 Sintesi di DNA complementare (cDNA)
a doppia elica.
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19.3 GENOTECHE LIBRERIE DI DNA GENOMICO
(gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)
Figura 19.15 Clonaggio di cDNA in vettori
plasmidici (A) e vettori derivati dal
batteriofago ? (B).
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
Figura 19.16 Screening di una libreria plasmidica.
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
Figura 19.17 (A) Rappresentazione schematica di
una membrana BAC. (B) Elenco ordinato delle
piastre contenute in ogni campo.
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
Figura 19.18 Film autoradiografico
ottenuto ibridando una membrana di una libreria
BAC con una sonda RFLP (le frecce indicano i
possibili cloni BAC contenenti lallele
marcatore).
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
GENOME COVERAGE DI UNA LIBRERIA
Tabella 19.2 Copertura genomica di librerie BAC
di A. thaliana e di alcune delle principali
specie di interesse agrario.
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
GENOME COVERAGE DI UNA LIBRERIA
Tabella 19.3 Numero (N) teorico di cloni
richiesti per avere una probabilità pari al
99 che un determinato clone sia rappresentato
nella libreri considerando inserti di 40 kb
(cosmidi), 150 kb (BAC) e 500 kb (YAC) di
lunghezza e con riferimento a diverse specie di
interesse agrario.
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
Figura 19.19 Screening di una libreria fagica per
la ricerca di uno specifico clone.
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19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE
GENETICHE
Figura 19.20 Risultato di una analisi autoradiogra
fica di un filtro ibridato con uno specifico
anticorpo marcato per lidentificazione di
colonie di una libreria esprimenti una
determinata proteina.
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19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENI
Figura 19.21 Metodo di sequenziamento a
terminazione di catena ideato da Sanger, chiamato
anche metodo dideossi.
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19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENI
Figura 19.22 Diversi tipi approccio per il
sequenziamento con primer universali (disegnati
sulle braccia del vettore) e primer interni
(disegnati sullinserto clonato nel vettore).
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19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENI
Figura 19.23 Lastra autoradiografica di una
sequenza nucleotidica ottenuta con sistema
manuale seguendo il metodo dideossi.
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19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENI
Figura 19.24 Sequenziamento automatico.
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19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI
Figura 19.25 Sequenziamento dei cromosomi in
ordine gerarchico (A) e col metodo shotgun (B).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Figura 19.26 Confronto tra vettori virali e
plasmidici riguardo alle loro modalità di
espressione.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Figura 19.27 Elementi costitutivi essenziali di
un genoma virale e vettore modello per
lespressione transiente di un gene esogeno in
pianta.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Figura 19.28 Dischi fogliari con accentuata
emissione di radici avventizie (hairy roots) in
seguito ad infezione con A. rhizogenes.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Figura 19.29 Rappresentazione schematica di un
plasmide Ti con i principali elementi costitutivi.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Tabella 19.4 Elenco di sistemi di geni marcatori
selezionabili e di geni reporter usati per la
trasformazione genetica delle piante.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Figura 19.30 Vettore di clonaggio derivante dalla
ricombinazione omologa di un vettore
cointegrato con uno intermedio.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E
AGROBATTERI
Figura 19.31 Rappresentazione schematica di un
vettore binario e di un plasmide helper in
agrobatterio.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
METODI CHIMICO-FISICI DI TRASFERIMENTO GENICO
Figura 19.32 Metodo di trasformazione
genetica mediato dal plasmide Ti di Agrobacterium
tumefaciens metodo biolistico di trasformazione
genetica basata sullimpiego del particle
gun (Adattato da C.S. Gasser e R.T. Fraley
(1992) Transgenic Crops, Scientific American
Inc.).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI
Figura 19.33 Vettori plasmidici impiegati per la
trasformazione del genoma di cloroplasto vettore
contenente sia il gene esogeno che il gene
marcatore selezionabile (A) vettori distinti
contenenti il gene esogeno oppure il gene
marcatore selezionabile (B). In entrambi i casi
le sequenze geniche sono fiancheggiate da una
regione di DNA del cloroplasto.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI
Figura 19.34 Proteina fluorescente verde o GFP
(green fluorescent protein) modello
tridimensionale della proteina (A) e
localizzazione subcellulare della proteina (B).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI
Figura 19.35 Sezione di tessuto fogliare con
cellule competenti, non competenti e
potenzialmente competenti alla rigenerazione
e/o alla trasformazione.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI
Figura 19.36 Segregazione 31 di un ipotetico
marcatore PCR-derivato osservata nella
discendenza T1 ottenuta autofecondando una pianta
T0 avente una singola copia del transgene.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI
Figura 19.37 Biosintesi delle antocianine (Fonte
B.R. Glick e J.J. Pasternak (1988) Molecular
biotechnology. Principles and applications of
recombinant DNA. American Society for
Microbiology).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI
Figura 19.38 Schema semplificato del processo di
infezione da parte di Agrobacterium tumefaciens e
di integrazione del T-DNA nel cromosoma della
pianta ospite. Immagine al microscopio
elettronico di agrobatteri e particolare di
tumore del colletto (crown gall) nella vite.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE
TRANSGENICHE
Figura 19.39 Statistiche relative alle piante
geneticamente modificate.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE
TRANSGENICHE
Tabella 19.5 Lista delle principali PGM di I
generazione autorizzate allimmissione sul
mercato nei Paesi extra UE.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE
TRANSGENICHE
Tabella 19.6 Lista delle principali PGM di II
generazione oggetto di sperimentazione in pieno
campo.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Migliorame
nto delle caratteristiche nutrizionali
Figura 19.40 (A) Percorso biosintetico
semplificato degli amminoacidi derivanti
dallacido aspartico (la retroinibizione o
inibizione a feedback è evidenziata in rosso)
(B) vettore plasmidico usato per la
trasformazione di soia e colza allo scopo di
modificare il tenore di lisina nei semi (Pv5 e
Pv3 promotore e terminatore del gene della
ß-faseolina di fagiolo cts regione codificante
il peptide di transito del cloroplasto dapA
gene di Corynebacterium codificante una
acido diidropicolinico-sintasi (DHDPS)
insensibile alla lisina lysCM4 membro mutante
di un gene di E. coli codificante una
aspartato-chinasi (AK) insensibile alla lisina.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Migliorame
nto delle caratteristiche nutrizionali
Figura 19.41 Produzione di ß-carotene nel riso
transgenico.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Migliorame
nto delle caratteristiche nutrizionali
Figura 19.42 Chicchi di riso dorato, Golden
rice.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze
agli erbicidi
Tabella 19.7 Alcuni esempi di erbicidi con
diversa modalità di azione e di enzimi codificati
da geni clonati per lo più nei procarioti ed
impiegati per produrre piante transgeniche
resistenti agli erbicidi.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE
Figura 19.43 Mappa del T-DNA di un costrutto
chimerico.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze
a stress biotici (patogeni)
Figura 19.44 Batteri di Bacillus thuringiensis
(A) ed esempi di piante transgeniche resistenti
agli insetti danni da piralide in spighe e culmi
di mais (B, C) varietà di mais Bt (D) foglie di
una varietà di soia Bt e di una normale (E,F)
capsule di una varietà di cotone Bt e di una
normale (G,H).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze
a stress biotici (patogeni)
Figura 19.45 Mortalità delle larve del coleottero
Callosobruchus maculatus sulle piante di pisello
transgenico in relazione alla quantità di
inibitore della-amilasi.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze
a stress biotici (patogeni)
Figura 19.46 (A) Strategia antisenso la
trasformazione di piante con geni aventi un
orientamento inverso rispetto alle regioni di
regolazione determina il blocco della espressione
del corrispondente gene endogeno. (B) Pomodori
transgenici e prodotto commerciale americano a
base di pomodori transgenici.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Tolleranza
a stress abiotici (ambientali)
Figura 19.47 Ruolo degli essudati radicali
(ER) nei suoli acidi e in quelli alcalini.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo
dello sviluppo e del sistema riproduttivo
Figura 19.48 Melanzana partenocarpica (foto A.
Spena).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo
dello sviluppo e del sistema riproduttivo
Figura 19.49 Tecnologia gene terminator.
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo
dello sviluppo e del sistema riproduttivo
Figura 19.50 Fiore wild-type (A) e del mutante
partenocarpico di pomodoro pat-2 (B, notare
laccrescimento precoce dellovario), Bacche
wild-type (C) e del mutante pat-2 (D, notare
lassenza di seme) (foto P. Mosconi).
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19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
(PGM) METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA
APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo
dello sviluppo e del sistema riproduttivo
Tabella 19.8 Esempi di partenocarpia naturale,
artificiale e biotecnologia scoperta o ottenuta
in diverse specie di interesse agrario.
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19.7 TRASFORMAZIONE GENETICA COME STRUMENTO PER
LO STUDIO DELLA FUNZIONE GENICA RNA
INTERFERENCE (RNAi) E SILENZIAMENTO GENICO
POST-TRASCRIZIONALE
Figura 19.51 RNA interference meccanismo di
azione.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
Figura 19.52 Struttura della molecola di un
anticorpo.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE
PIANTE
Tabella 19.9 Espressione di anticorpi in piante
transgeniche.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE
PIANTE
Figura 19.53 Costi per grammo di immunoglobulina
A prodotta con diversi sistemi di espressione.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI VACCINI (PROTEINE IMMUNOGENE) EDULI
NELLE PIANTE
Tabella 19.10 Piante transgeniche che producono
proteine potenzialmente utilizzabili come vaccini.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI
PROTEINE UMANE NELLE PIANTE
Tabella 19.11 Produzione di composti biofarmaceuti
ci con piante transgeniche per la terapia medica
nelluomo.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI
PROTEINE UMANE NELLE PIANTE
Figura 19.54 Rappresentazione schematica della
GAD65 umana sono evidenziati il segnale di
ancoraggio alle membrane, il sito cataliticoe gli
epitopi immunoreattivi della proteina.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI
PROTEINE UMANE NELLE PIANTE
Figura 19.55 Immagine al microscopio elettronico
del tessuto fogliare di piante transgeniche di
tabacco che evidenzia la localizzazione
subcellulare della hGAD65 a livello di
cloroplasti e mitocondri. La immuno-marcatura in
situ è stata condotta utilizzando anticorpi
specifici per la hGAD65.
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19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E
VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI
PROTEINE UMANE NELLE PIANTE
Figura 19.56 Localizzazione sub-cellulare della
GAD67/65 la fotografia, ottenuta tramite
microscopia elettronica del tessuto fogliare di
piante transgeniche di tabacco dopo
immuno-marcatura con anticorpi specifici per la
GAD67/65, mostra segnali a livello citosolico.