NAZLI A. ERCIYES

1
MOLEKÜLER MARKIRLAR

• NAZLI A. ERCIYES
• 200620102007
• IIÖ

2

• Moleküler markirlar genom üzerindeki herhangi bir
  bölgeyi isaretleyip belirlemede kullanilan
  yöntemlerdir.
• MOLEKÜLER MARKIRLARIN MORFOLOJIK
  MARKIRLARDAN FARKI
• 1) KALITATIF VE KANTITATIF BAGIMSIZLIK Çevre,
  gelisme dönemi ve arastiricilarindan
  kaynaklanabilecek hatalarin azligi.
• 2) YÜKSEK ORANDA POLIMORFIK Bir genomda bulunan
  toplam baz sayisi kadar polimorfiklik
  saptanabilir.
• 3) ÇOKLUK Çok sayida moleküler markir olmasina
  karsin morfolojik markir sayisi azdir.
• 4) KO-DOMINANTLIK Bir lotusta mümkün olabilecek
  genotip belirlenebilir.
• 5) GEN X GEN INTERAKSIYONU Epistatik ve
  pleotropik degildir.
• 6) HIZLILIK VE EKONOMiKLiK
• 7) ÜNiVERSALLIK

3
Moleküler Isaretleyiciler

• RESTRiKSiYON ENZiM VE HiBRiDiZASYON
• TABANLI
• Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (Restriction
  Fragment Lenght Polymorphism, RFLP)
• Minisatellit (Minisatellite)
• Nokta Hibridizasyonu (Dot Blot)

4
POLiMERAZ ZiNCiR REAKSiYONU VERESTRiKSiYON ENZiM
TABANLI

• Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi-Polimeraz
  Zincir
• Reaksiyonu (Restriction Fragment Length
  Polymorphism-PCR, RFLP-PCR)
• Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Uzunluk
  Polimorfizmi (PCR-Restriction Fragment Length
  Polymorphism, PCR-RFLP) veya Bölünerek-
  Çogaltilmis Polimorfik DNA Dizileri (Cleavage
  Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)
• Terminal Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi
  (Terminal Restriction Fragment Length
  Polymorphism (T-RFLP)
• Çogaltilmis Parça Uzunluk Polimorfizmi
  (Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

5
POLIMERAZ ZINCIR REAKSIYONU TABANLI

• ? Primere Tabi Polimeraz Zincir Reaksiyonu
  Polimorfizmi (Arbitrary Primed PCR, AP-PCR)
• ? Rastlantisal Çogaltilmis DNA Polimorfizmi
  (Random Amplified Polimorphism DNA (RAPD)
• ? Çogaltilan DNA Parmakizi (DNA Amplification
  Fingerprinting, DAF)
• ? Mikrosatellitler veya Basit Tekrarli Diziler
  Polimorfizmi (Microsatelites (Simple Sequence
  RepeatsPolymorphism, SSRP)

6

• ? Çogaltilan Sekans Polimorfizmi (Sequence
  Related Amplified Polymorphism, SRAP Belirli
  Dizileri Çogaltilan Bölgeler (Sequence
  Characterised Amplified Region, SCAR)
• ? Basit Sekans Tekrarlari Arasi Polimorfizmi
  (Inter simple sequence repeats, ISSR)
• ? Dogrudan Çogaltilan Uzunluk Polimorfizmi
  (Direct Amplification of Length Polymorphism,
  DALP)
• ? Allele Bagli Özgün Primerler (Allele-specific
  Associated Primers, ASAPs)
• ? Ligaz Zincir Reaksiyonu (LCR)

7

• DNA DIZI VE ENZIM TABANLI
• Klevaz Kisim Uzunluk Polimorfizmi (Cleavase
  Fragment length polymorphism, CFLP)
• Kimyasal Mismaç Kesimi (Chemical cleavage of
  mismatches (CCM))
• DNA DIZI TABANLI
• Tek Nükleotid Polimorfizmi (Single Nucleotide
  Polymorphism, SNP)
• Heterodupleks Analizi (Heteroduplex analysis, HA)
• Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi (Single
  stranded conformational polymorphism, SSCP)
• Dogrudan Dizi Analizi (Direct Sequencing)
• Genler Arasi Bölgeler (Internal Transcribed
  Spacers, ITS)
• Rastlantisal Çogaltilmis Mikrosatellit
  Polimorfizmi (Randomly Amplified Microsatellite
  Polymorphisms, RAMPO)

8
RFLP analiziRestriction parça uzunlugu
polimorfizmi

• Restriksiyon endonükleaz enzimlerinin
  kullanildigi bu yöntemde, Restriksiyon
  endonükleazlar, restriksiyon bölgeleri olarak
  bilinen çift zincirli DNA'nin sadece spesifik baz
  dizilerini tanimakta ve diziyi bu bölgelerden
  kesmektedir.
• RFLP analizi viral suslardaki mutasyonlari
  saptamada, viral epidemileri belirlemede
  kullanilmaktadir.

9
RFLPnin asamalari

• Biyolojik materyalden genomik DNA izole edilir,
  ve bunlar bir RE ile kesilirler,
• Kesilmis DNAlar elektroforeze tabi tutulurlar,
• Polimorfik bölge olup olmadigina bakilir (EtBr
  ile isaretlendikten sonra gözle ayirt
  edilemiyorsa veya dogrulamak için Southern
  Blottan sonra)

10
AFLPÇogaltilmis parça uzunlugu polimorfizmi

• Bu teknik RFLP'den daha hizli çalisir ve DNA
  örneklerini çogaltmak için PCR kullanir. Degisken
  sayili bitisik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine
  dayali aleller ayirdedilir, bunlar poliakrilamit
  jel elektroforezi ile ayristirilir.
• Bantlar gümüs boyamasi ile görülür. Analiz jelde
  yapildigi için, çok yüksek sayili tekrarlar jelin
  tepesinde sikisabilirler ve birbirlerinden
  ayirdedilmeleri zor olabilir.
• AmpFLP analizi yüksek oranda otomatiklestirilebil
  ir. Bu yöntemle kisisel DNA örnekleri
  karsilastirilarak filogenetik agaçlar
  yaratilabilir. Düsük maliyeti, hazirlanma ve
  çalistirma kolayligi gibi nedenlerden dolayi
  AmpFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yaygin olarak
  kullanilir .

11
PCR

• Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ,DNA içerisinde
  yer alan,dizisi bilinen iki segment arasindaki
  özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çogaltmak için
  uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.
• Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin
  uygun kosullarda çogaltilmasi esasina dayanir.
  Bir çesit "in vitro klonlama" olarak da
  tanimlanan , PCR Reaksiyonu
• Denatürasyon DNAnin iki zincirinin yüksek isi
  ile birbirinden ayrilmasi (95C)
• Annealing (yapisma) sentetik oligonükleotidlerin
  hedef DNA'ya baglanmasi (65C),
• Elongasyon(uzama) zincirin uzamasi ve çift
  iplikçikli DNAnin sentezi (72C) asamalarinin
  belirli sayida tekrarina dayanir. Bu üç adim bir
  PCR döngüsünü olusturur.

12
STR analiziKisa bitisik tekrarlar

• Günümüzde kullanilan DNA profillemesi PCR ve kisa
  bitisik tekrarlara (Ing. short tandem repeats
  veya STR) dayalidir. Bu yöntemde kisa tekrar eden
  DNA dizilerine sahip, son derece polimorfik
  bölgelere bakilir (en yaygin olarak tekrar eden 4
  bazli bölgelere bakilir ama 3, 5 ve baska sayida
  baz tekrarlari da kullanilir).
• Akraba olmayan kisilerde bu tekrar eden
  birimlerden farkli sayilarda oldugu için, bu DNA
  bölgeleri birbirlerine akraba olmayan kisilerin
  ayirdedilmesinde kullanilabilir. Bu STR lokuslari
  (konumlari) dizi-spesifik primerler kullanilarak
  PCR ile çogaltilir. Elde edilen DNA parçalari
  sonra elektroforez ile ayristirilir ve tespit
  edilir. Bu amaç için kullanilan iki elektroforez
  yöntemi vardir, kapiler elektroforez ve jel
  elektroforezi

13

• Kapiler elektroforezde, içi bir polimerlerle dolu
  ince cam tübün (kapiler veya kilcal tübün) içine
  DNA parçalari bir elektrik alaninin etkisiyle
  (elektrokinetik olarak) enjekte edilir. Sonra,
  gene bir elektrik alaninin etkisiyle DNA
  parçalari bu tüp içinde, küçük parçalar büyük
  olanlardan daha hizli olmak üzere, ilerler.
• PCR sirasinda kullanilan primerlere baglanmis
  flüresan etiketler sayesinde kapiler tüpte
  ayristirilan DNA parçalarin hangi tepkimenin
  ürünü oldugu anlasilabilir.
• Bu sayede birden çok DNA parçasinin PCR ile
  çogaltilmasi ve beraber elektroforez edilmesi
  mümkün olur, buna multipleksleme denir.

14

• Farkli büyüklükte ve isaretlenmis DNA
  standartlarinin her bir örnege dahil edilmesi ile
  parçalarin büyüklükleri belirlenir, bu büyüklük
  bilinen tüm alelleri listeleyen bir tablo ile
  karsilastirilarak polimorfik tekrar sayisi
  bulunur.
• Bu yöntem pahali olmakla beraber yüksek
  kapasiteli makinalar kullanilarak örnek basina
  daha düsük bir masrafa ulasmak ve çogu adli
  laboratuvardaki is yükünü azaltmak mümkündür.
• Jel elktroforezi kapiler elektroforeze (KE)
  benzer bir prensibe göre çalisir ama DNA
  parçalarini ayristirmak için kapiler tüp yerine
  iki cam tabaka arasinda olusturulmus bir
  poliakrilamit jel kullanilir

15
SRAP SEKANS ILISKILI ÇOGALTILANPOLIMORFIZM

• 17 ile 20 nt arasinda kullanilan özel primerlerle
  genomda
• kodlama yapan DNA parçalarini çogaltamaya dayali
  bir
• metottur. Ko-dominantlik ve tekrarlanabilme
  özeligi,
• morfolojik karakterlerle iliskilerinin fazlaligi
  avantajlari
• arasinda yer alirken özel primer istegi ise bir
  dezavantajdir
• SRAP iki özel primer kullanir (bir brimer çifti)
  bu
• primerlerin 13 ile 15 nt uzunlugundaki sol tarafi
  (5.-)
• degisik bazlardan olusur ve CCGG bazlariyla
  uzatilir.
• Diger primer ise yine benzer seklide olup 3.- ucu
  AATT
• bazlariyla bitirilir.

16
ISSR BASIT SEKANS TEKRARLAR ARASIPOLIMORFIZIM

• Bu teknikte genellikle tek bir primer kullanilir.
• Primer uzunlugu 16-20 nt olup duruma göre
  primerin uçlarindan biri 2-4 baz uzatilir.
  Primerin bu uzantilar içerisindeki kisminda
  tekrarli bazlar bulunur.
• ISSR primerine örnek
• 5.-ACACACACACACACACCTC-3.
• Burada CCTC ardisik tekrarin 3.- ucuna eklenen
  nükleotidleri gösterir
• Çok sayida lokus ayni anda izlenebilmektedir.

17
SSR BASIT SEKANS TEKRARLARIPOLIMORFIZIM

• Basit tekrarli DNA dizileri genelde bir ile 6
  nükleotit uzunlugunda bazlarin ardisik olarak
  bulunmasi olayidir.
• Örnegin ikili tekrar ATATATATATATATATATAT
• seklindedir. Burada ardisik olarak tekrar eden
  bazlar AT'
• dir ve bu örnekte AT 10 kez tekrarlanmaktadir.
• Herhangi bir DNA'nin basit tekrarli olarak
  isimlendirilebilmesi için önce belirli bir
  motifin yukaridaki örnekte motif AT'dir ve bu
  motifin belirli bir sayida bulunmasi gerekir.
• Genelde ikili bir motifte motif sayisinin en az 8
  olmasi bu sekansa basit tekrarli sekan olarak
  adlandirilmasini saglar

18

• Bu teknik günümüzde oldukça fazla kullanilan bir
  tekniktir.
• Nedeni ise polimorfizm orani oldukça fazla olmasi
  yaninda tekrarlanabilirligi (farkli kisilerin
  farkli labaratuarlarda yapimis oldugu deneylerden
  ayni sonuç almalari) oldukça fazla olan bir
  yöntemdir.
• Bir PCR metodu olmasi kolay uygulanabimesini
  saglar.
• Ancak bu markir sisteminin uygulanabilmesi için
  çalisilan organizmaya ait primerlerin yani SSR
  primerlerinin önceden bilimesi gerekmektedir

19

• SSR primerlerinin üretiminde genel olarak üç
  farkli yaklasim tercih edilmektedir.
• Bunlar (1) genomik DNA kütüphanelerinin SSR
  oligonükleotidleri ile hibridizasyonu yoluyla
  gözlenmesi
• (2) DNA veri bankalarinda SSRlerin
  arastirilmasi
• (3) akraba bitki türlerinde gelistirilmis olan
  SSR-spesifik primerlerin kullanimidir.

20

• Mikrosatellitlerin en büyük dezavantaji yeni
  markör gelistirilmesinin güçlügüdür.
• Yeni markörlerin gelistirilmesi için genomik DNA
  klonlarinin tekrarlanan oligonükleotid içeren
  problarla melezlenme yoluyla bulunmasi, nükleotid
  dizilislerinin belirlenmesi ve yanyana
  tekrarlanan yapilarin baslangiç ve bitis
  yerlerinden özel baglatici DNAlar gelistirilmesi
  gerekmektedir.
• Bu da oldukça fazla isgücü gerektiren pahali bir
  islemdir.

21
SCAR DIZILERI BELIRI ÇOGALTILAN BÖLGELER

• Bu markir sistemi genellikle RAPD veya AFLP
  metotlariyla çogaltilmis tek bir amplikonun
  primer uzunlugunu yaklasik ikiye katlayarak
  yeniden çogaltilmasina dayanir.
• Kisaca tek fragmentini temsil eden lokus önce jel
  üzerinden alinir, orijinal primerle tekrar
  çogaltilir ve çogaltilan DNA parçasinin sekansi
  yapilir.
• Yeni primerler eski primer sekanslarini ve ek
  olarak yeni DNA dizileri içerir.

22

• Bu metodla RAPD veya AFLP teknikleri dominant
  özellikten ko-dominant özellige, tekrarlanma
  özelligi artirilmaktadir. SCAR primerlere genelde
  18-24 oligo uzunlugundadir.
• Avantajlari PCR metodu oldugundan, Yüksek
  kalite ve miktarda DNA.ya ihtiyaç yoktur.
  Tekrarlanabilme kapasitesi oldukça yüksektir.
• Dezavantaji DNA sekanslamasina ihtiyaç duyar.

23
SSCP Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi

• Ayni büyüklükteki DNA parçalarini ayirmakta
  kullanilan bir metottur. Bu metotta tek sarmalli
  DNAnin non-denatürasyon poliakrilamid jel
  elektroforezindeki hareketi izlenir.
• Bu teknigin temelini jel üzerinde elektroforez
  olan bir DNA nin hareketi DNA nin büyüklügü ve bu
  DNA yi olusturan sekanslarin içerigine ve bu
  içerikten dolayi DNA parçaciginin kendi üzerine
  baglanma veya degisik sekiller almasina dayanir.

24

• Bu teknik 100 ile 400 nükleotid uzunlugundaki
  DNA.larda uygun sonuçlar verebilmektedir.
• Bu teknik uygun büyüklükteki PCR amplikonlarina
  uygulanir ve PJE yöntemiyle ayristirilir. Izotop,
  EB veya gümüs nitrat yöntemiyle görüntülenebilir.

25
RAPD Raslantisal Çogaltilmis DNA Farkliligi

• Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunlugundaki
  primer (baslatici) tek sarlmalli DNAlar
  kullanilarak genom üzerinde rastgele bölgelerin
  DNA amplifikasyonu gerçeklestirilir.
• Reaksiyon sartlarinin spesifik olmamasi rastgele
  çogaltima izin verir.
• Yaygin olarak diger PCR uygulamalarinin aksine
  iki degil tek bir primer kullanilir.

26

• Ancak bu baslatici her iki yöndeki DNA üretimi
  için de kullanilir.
• Dolayisiyla kullanilan baslaticinin DNA üzerinde
  birbirine yakin iki bölgeye yapisabildigi genom
  bölgelerinin amplifikasyonu yapilir.
• Üretimi yapilan DNA parçalari (amplikon) agaroz
  jel üzerinde elektroforeze tabi tutuldugunda bazi
  parçalarin bazi genotiplerde üretilip bazilarinda
  üretilmedigi gözlenir

27

• RAPD Avantajlari
• 1. RFLP.den daha fazla polimorfik
• 2. Basit ve hizli
• 3. Markirlari çevre sarlarindan ve gelisme
  dönemlerinden etkilenmez
• 4. Radyoizotoplar kullanmaz
• 5. Mutasyona bagli amlifikasyon
• 6. Az genomik DNA
• 7. Primer basina fazla markir üretebilir
• 8. Üniversal primerler kullanir
• RAPD Dezavantajlari
• 1. Tekrarlanabilirligi zayif
• 2. Dominant markir
• 3. Polimorfizim orani diger bazi markirlardan az

28
VNTR(Minisatellitler)

• VNTRlarde tekrar eden dizi 9-80 bç arasinda
  olabilmektedir.
• Her lokusta çok sayida alel olmasi VNTRlarin
  ayirim gücünü artirmakta, ancak alel boyutlari
  büyük oldugundan çok iyi korunamamis örneklerde
  amplifikasyon sorunlari yasanabilmektedir. Bundan
  dolayi kullanim alani sinirli kalmistir.

29
Tahil ürününün en yaygin kullanilan marker
sistemleri ile Karsilastirmasi

• Özellik RFLPs
  RAPDs AFLPs SSRs
  ISSR
• DNA(mikrogram ) 10
  0,02 0,5-0,1 0.05
  0,05
• DNA KALITESI yüksek
  yüksek orta orta
  yüksek
• PCR TABANLI yok evet
  evet evet
  evet
• KULLANIM
• KOLAYLIGI kolay degil
  kolay kolay kolay
  kolay
• OTOMASYON düsük orta
  orta yüksek yüksek
• TEKRARLANABILIRLIK yüksek güvenilmez
  yüksek yüksek yüksek
• GELISTIRME
• MALIYETI düsük
  düsük orta yüksek
  yüksek
• ANALIZ BASINA
• MALIYET yüksek
  düsük orta düsük
  düsük

30
DNA SEKANSLAMA

• DNA parçasinin veya herhangi bir genomun tüm
  nükleik asit dizisinin yani A, T, C, ve G.lerinin
  belirlenmesidir.
• Maxam Gilbert, Kimyasal sekanslama
• Sanger, Dideoksinükleotit Yöntemi
• Günümüzde Sanger metodunun prensipleri
  kullanilarak sekanslama islemleri
  gerçeklestirilmektedir.

31

• Sanger Yöntemi Için
• 1) Kalip DNA kopyalari (DNA Sekansi Belirlenecek
  olan)
• 2) Uygun bir primer kopyalari
• 3) DNA polimeraz
• 4) Normal deoksinükleotitler (dATP, dTTP dGTP,
  dCTP)
• 5) Dideoksinükleotitler ( Izotop veya Floresan
  eteiketli ddTTP, ddATP, ddCTP, ddGTP)
• Teknik birbirlerine komplimentar olan tek
  sarmalli
• DNA larin uygun ortamlarda birbirleriyle baz
  çifti prensibine göre baglanmalari prensibine
  dayanir.

32

• http//www1.akdeniz.edu.tr/ziraat/tr/dersler/genet
  ikmuh_07.pdf
• http//www.abgeder.org/Bio1Gonul.pdf
• http//www.abgeder.org/Bio1Behnan.pdf
• http//tr.wikipedia.org/wiki/DNA_profillemesi
• http//www.fao.org/biotech/docs/Korzun.pdf
• http//web.inonu.edu.tr/iozerol/rdurmaz/UygMolMi
  kr/149.pdf
• http//tr.wikipedia.org/wiki/Polimeraz_zincir_tep
  kimesi
• http//www.vtunnel.com/index.php/1010110A/bb8cfd09
  a195d37da6046b345ba286ff1e154a5b9e249d7e0247b8b76e
  dd23041ab94bd42f3323e757969782556ecfeb69f4f41d3ee8
  e4e015650