Aplicaciones de la PCR y otras tйcnicas de genйtica molecular en ganaderнa: enfermedades hereditarias y no hereditarias

1
Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de
genética molecular en ganadería enfermedades
hereditarias y no hereditarias

• Inmaculada Martín Burriel
• minma_at_unizar.es

2
Enfermedad genética

• Desviación del estado de salud debida total o
  parcialmente a la constitución genética del
  individuo, en el que factores ambientales pueden
  cumplir una función importante en la expresión y
  gravedad de los defectos o síntomas

3
Cómo reconocerlas?

• Historia familiar análisis de pedigríes

Reconocimiento del modo de herencia
Control de filiación
Especies Perros, Caballos, Vacuno lechero
4
Cómo reconocerlas?

• Epidemiología de la enfermedad
• Aparición de casos puntuales
• Aparición en estirpes

Análisis de pedigríes
Determinación del tipo de herencia
5
Cómo reconocerlas?

• Examen físico
• Buscar cambios estructurales, fenotipos
  característicos, alteraciones en las manos, pies,
  piel, pelo, etc.

6
Cómo reconocerlas?

• Examen laboratorial
• Estudios bioquímicos, inmunológicos,
  citogenéticos y de genética molecular.

7
Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria
Fenotipo (enfermedad) genotipo ambiente
Factor genético

• Enfermedades (o rasgos) monogénicas
• Con herencia mendeliana más o menos regular
• Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc.
• Enfermedades de herencia multifactorial
• Poligénicas
• Monogénicas con importante componente ambiental
• Enfermedades de origen cromosómico
  (cromosomopatías)
• Se detectan al microscopio
• Se originan en la meiosis
• No heredables o herencia irregular
• Afectan a muchos genes ? cuadro grave, muchos
  letales

8
Caracteres Mendelianos
Online Mendelian Inheritance in Animals
http//omia.angis.org.au/
20/01/09
9
Enfermedades en bovino

• CVM (malformación vertebral compleja)
• BLAD
• DUMPS
• HIPERTROFIA MUSCULAR hm
• MULEFOOT O SINDACTILISMO
• CITRULINEMIA

http//www.gov.on.ca/OMAFRA/english/livestock/beef
/facts/93-007.htm
10
(No Transcript)
11
(No Transcript)
12
(No Transcript)
13
(No Transcript)
14
(No Transcript)
15
(No Transcript)
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
DIAGNOSTICO DE BLAD
Diagnóstico PCR Taq I
D/G
D/G
D/G
D/G
D/D
G/G
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

25
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la
ryanodina
Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado)
26
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
DETECCIÓN POR LIGAMIENTO - Halotano -
Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)
27
(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
(No Transcript)
30
(No Transcript)
31
(No Transcript)
32
Factores genéticos de las EETs

• Introducción
• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

33
Animales
Humanas
Kuru Enfermedad de Creutzfeld-Jakob Insomnio
Familiar Fatal
Encefalopatía Espongiforme Bovina Enfermedad
Transmisible del Visón SCRAPIE (Tembladera) ovino
y caprino
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

• hereditaria
• esporádica
• - infecciosa

Susceptibilidad genética
34
Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES
Pérdida neuronal y gliosis
Depósitos de PrPSc
Espongiosis
Vacuolización
35
Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
Agente causal de tipo infeccioso
PrP (Proteína Prión)
PrPC
PrPSc
Cambio de conformación
Proteína sensible a proteasas
Proteína resistente a proteasas
depósito en tejidos celulares
Sistema linfoide
SNC
36

• Secuencia muy conservada en un gran número de
  especies (230-256 aa)
• Alto grado de polimorfismo

relacionado con
(humano, ovino y caprino)
37
Factores genéticos de las EETs

• Introducción
• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

38
Implicaciones genéticas de las EETs
NPU (1961) Selección intra-raza según la
resistencia a la infección de scrapie experimental
Interacción entre el genotipo del hospedador y
las cepas de scrapie.
39
Implicaciones genéticas de las EETs
NPU
Gen Sip (Scrapie incubation period) Gen mayor
que controla la duración del periodo de
incubación de scrapie.
sA (p.i. corto) gt pA (p.i. largo)
Dickinson (1968) Gen sinc (Scrapie
incubation) Estudios experimentales en ratones.
Comportamiento dependiente de la cepa de
scrapie (ME7 y 22A)
s7 (p.i. corto) gt p7 (p.i. largo)
40
Implicaciones genéticas de las EETs
Gen de la proteína prión (PRNP)

• La proteína priónica PrP aparece en la fracción
  infecciosa de los homogeneizados de scrapie.
• Asociación genética entre el gen PRNP y la
  longitud del periodo de incubación de scrapie en
  ratón.
• Identificación de mutaciones del gen PRNP en
  ciertas patologías humanas
• En ovino el gen mayor Sip está estrechamente
  ligado a PRNP .
• Ratones knock-out para el gen PRNP son
  resistentes a la enfermedad

41
Factores genéticos de las EETs

• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

42
Gen PRNP

• Longitud 16-22 kpb
• 2 o 3 exones según la especie
• Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb)
• Codifica una glicoproteína de membrana de entre
  230 y 250 aa según la especie
• Altamente conservado entre especies.

43
Gen PRNP
Exon1
Exon2
Exon3
ORF
3UTR
Proteína PrP murina
CHO
CHO
196
180
213
178
1
23
51
90
231
254
Péptido señal
Repet. octapéptidos
Unión GPI
S
S
Proteína PrP humana
1
245
Http//www.errnm.cbcu.carn.ac.uk
44
Gen PRNP
45
Gen PRNP
Identificación y localización del gen PRNP
46
Gen PRNP
Homología de secuencia
Humano vs Bovino Humano vs Ovino Bovino vs Ovino
66.7 65.4 94.0
Prusiner (1998)
47
Gen PRNP
Polimorfismos

• Mutaciones puntuales
• Inserciones y delecciones de octapéptidos

GTC GCC
Val Ala
PHGGGWGQ
48
Gen PRNP
Polimorfismos
Prusiner (1998)
49
Factores genéticos de las EETs

• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

50
Genética de las EETs humanas
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

• Polimorfismo más importante Codón 129

http//www.bse.org.uk/report/volume2
Met/Met Val/Val
Susceptibilidad
51
Genética de las EETs humanas
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Familiar

• Mutación más común en el codón 200
• - Sustitución de Lisina por Glutamina
• - 70 de familias
• Patologías distintas dependiendo de la
  combinación de mutaciones existente

52
Genética de las EETs humanas
http//www.bse.org.uk/report/volume2
53
Genética de las EETs humanas
http//www.bse.org.uk/report/volume2
54
Genética de las EETs humanas
http//www.bse.org.uk/report/volume2
55
Genética de las EETs humanas
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Esporádica
Hipótesis muy probable Se produce una mutación
somática del gen PRNP en un número muy reducido
de células.
56
Factores genéticos de las EETs

• Introducción
• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

57
Genética de las EETs en ratón
Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino

• Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan
  diferencias en el periodo de incubación de
  scrapie.
• Utilizado como modelo para confirmar la
  importancia de las mutaciones detectadas en el
  gen PRNP humano.
• Identificación de QTLs ligados al periodo de
  incubación del la enfermedad.

58
Genética de las EETs en ratón
Búsqueda de QTLs asociados a las EETs

• QTL Quantitative Trait Loci
• Caracteres cuantitativos determinados por el
  efecto aditivo de la acción de varios genes.
• El periodo de incubación es un carácter
  cuantitativo
• El ratón como animal modelo
• Razones económicas
• Control del manejo
• Disponibilidad de líneas consanguíneas con
  periodos de incubación muy distintos.

Loyd et al. (2001)
59
Genética de las EETs en ratón
Búsqueda de QTLs asociados a las EETs
CAST/Ei
NZW/OlaHsd
CAST/Ei
NZW/OlaHsd
F1
F2
Loyd et al. (2001)
60
Genética de las EETs en ratón

• Análisis de la F2
• Inoculación intracerebral con scrapie
• Determinación del periodo de incubación (1000
  anim)
• Análisis de 150 microsatélites (marcadores
  altamente polimórficos dispersos por todo el
  genoma)
• Análisis de ligamiento entre el genotipo de los
  marcadores y el periodo de incubación.

Chr. 2
Chr. 11
Chr. 12
Otros QTLs Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001)
Existen otros genes relacionados con el periodo
de incubación de la enfermedad
Loyd et al. (2001)
61
Factores genéticos de las EETs

• Introducción
• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

62
Genética de las EETs en ovino
Gen PrP ovino

• Tamaño del gen 20kpb
• Proteína de 256 aa
• Homología con bovino (94)
• Secuencia aminoacídica de la PrP bovina ? de la
  ovina en 7 u 8 posiciones
• Localización 13 (13q17/18)

63

• Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y
  cols., 2007)

4 codones asociados a susceptibilidad
64
Genética de las EETs en ovino

• Estudios de los diferentes codones según la raza
• Codón 136

VV136 Susceptibilidad AV136 Susceptibilidad AA
136 Susceptibilidad
AA depende de la raza
Cheviot Ile de France Flemish Swifter
Swaledale Texel Lacaune Romanov
Resistencia
Susceptibilidad
65
Genética de las EETs en ovino

• Estudios de los diferentes codones según la raza
• Codón 154
• Codón 171

RR154 No determinado RH154 Cierta
resistencia HH154 Resistencia
QQ171 Resistencia QR171 Resistencia RR171 Resis
tencia
1 Suffolk en Japón
66
Genética de las EETs en ovino

• Definidos los codones se establecen las posibles
  variantes

A R R A H Q A R H A R Q V R Q
Cierta resistencia
Cierta susceptibilidad
Susceptibilidad
67
Genética de las EETs en ovino

• Según el genotipo del animal y su comportamiento
  frente a la enfermedad se definen 5 categorías de
  riesgo
• R1 Riesgo muy bajo individual y de la progenie
• R2 Riesgo bajo individual y de la progenie
• R3 Riesgo bajo individual y progenie dependiente
  del otro parental
• R4 Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo
  que
• R5 El mayor riesgo a scrapie

68
Genética de las EETs en ovino

• Razas Charolaise y Blue de Maine

69
Genética de las EETs en ovino

• Razas Bluefaced y Leicester

70
Genética de las EETs en ovino

• Qué sucede en nuestras razas?
• Comunidad Autónoma de Aragón
• Qué sucede en los animales con scrapie
  pertenecientes a nuestras razas?
• Qué sucede en otras razas Mediterráneas?

71
Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés

• Determinación del riesgo genético de las razas
  ovinas aragonesas
• Rasa Aragonesa.
• Ojinegra.
• Cartera.
• Maellana.
• Ansotana.
• Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen
  PRNP.

Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
72
Material y Métodos

• - Razas estudiadas
• Rasa Aragonesa. (4 Rebaños)
• Ojinegra. (4 Rebaños)
• Cartera. (2 Rebaños)
• Maellana. (2 Rebaños)
• Ansotana. (1 Rebaño)
• - De cada rebaño Todos los machos reproductores
  y hasta 50 de hembras.
• - Extracción y purificación del DNA de sangre
  entera, usando el Kit de Amersham GFX Genomic
  DNA blood Minikit.

Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
73
Material y Métodos
- Condiciones de la PCR
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
74
Material y Métodos
- PCR/RFLPs
Codones 136 y 154 con BspHI. (ODoherty et
al., 2000) Codón 171 con BslI y AccI.
(Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999)
- SECUENCIACIÓN
Amplificación de toda la región
codificante. - F 5-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT
-3 - R 5-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3
Purificación del producto PCR
(NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel) y secuenciación.
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
75
Resultados
- PCR/RFLPs
127
179189
136 y 154
241
368
AR
PCR
AH
VR
60
81
91
171
171
PCR
Q/H
R
125
149
171
PCR
H
R/Q
PCR
ARR/ARR
ARR/AHQ
AHQ/AHQ
ARR/ARQ
ARQ/AHQ
ARR/ARH
AHQ/ARH
ARQ/ARQ
ARQ/ARH
ARQ/VRQ
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
76
Resultados
Porcentaje de animales según su nivel de riesgo
R1
Ansotana
Cartera
Maellana
R2
6
4
R3
15
14
R4
26
26
31
39
R5
44
47
48
R. Aragonesa46 ARQ/ARQ 2 ARR/ARQ
Ojinegra
Rasa Aragonesa
2
2
2.5
2.5
12
24
Scrapie
Acín et al. (2004) Vet Rec
72
83
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
77
Resultados
- SECUENCIACIÓN
Se ha confirmado la mayoría de los resultados
de RFLPs.
Codon 171

• Se detectó (Ojinegra) la variante rara
  (Lisina) en el codon 171.
• Se detectaron polimorfismos en 14 codones.
• Se detectaron nuevos polimorfismos en la
  especie ovina
• 101 (Q R)
• 151 (R G)
• 151 (R H)
• 172 (Y D)
• 175 (Q E)

Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
78
Conclusiones
Las razas ovinas autóctonas analizadas se
presentan como razas muy susceptibles al
padecimiento de scrapie. El gen PRNP presenta
una gran variabilidad en el ovino autóctono.
La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de
error en la lectura debido a la presencia de
alelos raros. La técnica de secuenciación
evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo
además detectar nuevos polimorfismos.
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
79
POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN OVINO MARROQUÍ
Serrano et al. (2007) Vet Rec
80
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
MATERIAL Y MÉTODOS

• Animales

OVINO MARROQUÍ 154 animales
89 Dman 43 Boujâad 22
Sardi

• Extracción de DNA de sangre entera

Genomic Blood DNA Purification Kit (GE
Healthcare)
Serrano et al. (2007) Vet Rec
81
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
MATERIAL Y MÉTODOS
PROTOCOLO de PCR
Serrano et al. (2007) Vet Rec
82
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
MATERIAL Y MÉTODOS

• Optimización de la reacción de secuenciación

Química Kit Big Dye Terminator (ddNTPs
fluorescentes)
Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización
ABI PRISM 3100

• Análisis estadístico (GENEPOP) cálculo de
  frecuencias alélicas,
• haplotípicas y genotípicas

Serrano et al. (2007) Vet Rec
83
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
RESULTADOS
Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit)
Electroferogramas de los fragmentos DNA
10 polimorfismos conocidos (112, 136, 141, 143,
154, 171, 172, 176, 231, 237)
silentes
Serrano et al. (2007) Vet Rec
84
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
RESULTADOS

• Polimorfismos relacionados con susceptibilidad

Frecuencias de haplotipo y genotipo / codones
136, 154, 171
(Mutaciones en codón 171)
Genotípicas
Haplotípicas
60
80
ARQ/ARQ
50
ARQ
60
40
ARR/ARQ
ARR
Frecuencia ()
30
ARR/ARR
40
Frecuencia ()
ARH
20
ARH/ARQ
20
10
0
0
Boujâad
D'man
Sardi
Boujâad
D'man
Sardi
(razas mediterráneas)
ARQ
ARQ/ARQ
ALTA SUSCEPTIBILIDAD
ARR/ARQ
CIERTA RESISTENCIA
ARR
SUSCEPTIBILIDAD
Serrano et al. (2007) Vet Rec
85
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
RESULTADOS

• Otros polimorfismos

Frecuencias alélicas
Sardi
Dman
Boujâad
Amino ácido
Secuencia
Codón
97.7
98.3
100
M
ATG
112
2.3
1.7
0
T
ACG
100
97.2
100
H
CAT
114
0
2.8
0
R
CGT
NUEVO
95.5
100
80.2
L
CTT
141
Nor98
4.5
0
19.8
F
TTT
97.7
92.15
82.5
H
CAT
143
2.3
7.85
17.5
R
CGT
100
100
98.83
N
AAT
146
NUEVO
0
0
1.17
S
AGT
100
82.05
100
Y
TAT
172
(Acín y cols., 2004)
0
17.95
0
D
GAT
97.7
97.75
97.65
N
AAC
176
2.3
2.25
2.35
K
AAA
22
89
43
Total
Serrano et al. (2007) Vet Rec
86
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
RESULTADOS
Frecuencias haplotípicas
Serrano et al. (2007) Vet Rec
87
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

• Primer análisis del gen PRNP en poblaciones
  ovinas africanas
• Gran variabilidad genética
• Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a
  pesar de
• ausencia de casos de scrapie ( Australia y Nueva
  Zelanda)
• Las mutaciones detectadas aparecen también en
  otras razas mediterráneas, posiblemente debido a
  la influencia de las migraciones desde el
  continente africano

Serrano et al. (2007) Vet Rec
88
Factores genéticos de las EETs

• Introducción
• Implicaciones genéticas de las EETs
• Gen PRNP
• Genética de las EETs en humanos
• Genética de las EETs en ratón
• Genética de las EETs en especies de abasto
• EETs en ovino (Scrapie)
• EETs en caprino y bovino

89

• 24 cambios aminoacídicos descritos en la región
  codificante
• (Acutis y cols., 2008)

• Mutación más frecuente

S240P

• 6 codones asociados con susceptibilidad a
  scrapie

I142M H154R W102G 3 repeticiones de octapéptidos
H143R N146S y N146D Q222K
Resistencia (Billinis y cols., 2002
Papasavva-Stylianou y cols., 2007 Vaccari y
cols., 2006)
90
POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES
CAPRINAS MARROQUÍES
Serrano et al. (en prensa) An Genet
91
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
MATERIAL Y MÉTODOS

• Animales

CAPRINO MARROQUÍ 137 animales
80 Dman 57
Chaouni

• Identificación de polimorfismos Secuenciación
  ( ESTUDIO 1)

• Determinación y diferenciación de haplotipos
  PCR alelo-específica

Secuenciación

• Análisis estadístico GENEPOP
• ARLEQUIN (estimación de frecuencias
  haplotípicas)

Serrano et al. (en prensa) An Genet
92
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS
10 polimorfismos conocidos
Análisis de electroferogramas (BioEdit)
3 NUEVAS MUTACIONES
Serrano et al. (en prensa) An Genet
93
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS

• Nuevas mutaciones

Frecuencias alélicas
Frecuencias bajas (lt 2 )
Serrano et al. (en prensa) An Genet
94
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS

• Polimorfismos conocidos

Frecuencias alélicas
Serrano et al. (en prensa) An Genet
95
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS
Mutaciones silentes
Codón 181
(1.8 en raza Dman)
(Goldmann y cols., 1996 Kurosaki y cols., 2005
Acutis y cols., 2006 Babar y cols, 2007)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
96
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
PCR alelo-específica
Codón 154
Codón 240
Codón 42
Codón 138
101
138
S
P
S
CC
AG
CC
C
T
A
G
T
C
Codón 101
Codón 139
(PrP) Rev
Heterocigotos
Codón 145
Secuenciación (cebador específico- S240)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
97
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS
S240 P240

• Determinación de haplotipos

PCR alelo-específica
12 haplotipos (3 nuevos) 28 genotipos diferentes
Frecuencias haplotípicas
10 Chaouni 13 Dman
17 Estimados
(4 no reales)
(ARLEQUIN)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
98
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

• Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas
  africanas
• Gran variabilidad genética
• Cierta resistencia a scrapie (H154)
• Proximidad genética con razas caprinas
  mediterráneas de
• Italia y Grecia

Serrano et al. (en prensa) An Genet
99
Genética de las EETs en bovino
Gen PrP bovino

• Secuencia aminoacídica de la PrP bovina ? de la
  ovina en 7 u 8 posiciones.
• Polimorfismos
• 22 mutaciones silentes
• 12 cambios aminoacídicos
• Repeticiones de octapéptidos
• 5 copias (5/5).
• 6 copias (6/6). El más común
• 5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto).

Sin relación con la susceptibilidad a BSE
100
Genética de las EETs en bovino

• Posible control genético
• Formas clásicas de BSE cambios en la expresión
  de PrPC
• 23 bp del en la región promotora? elimina un
  sitio de unión de RP58
• 12 bp del en intrón 1? elimina el sitio SP1 de
  unión de FT.
• Forma atípica USA 2006
• E211K análogo al humano E200K responsable de TSE
  hereditaria
• Otros genes?
• Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez
  et al. 2002) BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6,
  13 y 19 (Zhang et al., 2004).

101
(No Transcript)
102
ENFERMEDADES ENDEMICAS
Riesgo calidad de vida - Salud Morbilidad y
mortalidad
SALUD Impacto económico y social Diagnóstico
precoz

• PROTOZOOS del género Leishmania
• Enfermedad que afecta al hombre y perro
• ZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON
• (OMS indicadora de SIDA)

103
LEISHMANIOSIS
Presencia de factores ecológicos VECTORES RESERVO
RIOS ANIMALES COMO EL PERRO
Diagnóstico problemático

• TECNICAS CLASICAS
• Observación microscópica en ganglio o médula
• Métodos serológicosIFI
• NUEVAS TECNICAS
• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

104
PCR
Kinetoplastos Pequeños círculos de DNA con
genes repetidos

• SENSIBLE
• ESPECIFICA
• ECONOMICO
• EFICAZ
• Cebadores - Zona del genoma del parásito de
  varias copias

• SSUrRNA
• 18SrRNA
• Zonas bien conocidas en más de 100 especies
  Leishmania infantum, Trypañosoma brucei,
  Trypanosoma cruzi, ...

105
(No Transcript)
106

Ampliación del DNA

Termociclador 9600 Perkin Elmer

m
muestra 15
l.
94ºC --- 5'


94ºC --- 1'

35 ciclos
60ºC --- 1'


72ºC --- 1'

72ºC ---10'

4ºC --- hasta recoger muestra

107
(No Transcript)
108
DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA
Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de
100 veces
Muestra Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre.
-