Real Time PCR

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Real Time PCR
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O Que é?

• Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é
  simultânea a amplificação, não necessitando de
  etapas posteriores como gel de eletroforese ou
  detecção radioativa , like ELISA ou Blots.

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Tipos

• SYBR Green
• TaqMan/FRET
• Molecular Becons
• LUX
• Scorpions
• outros

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Vantagens

• Rápida ciclagem
• Alto Throughput
• Baixo risco de contaminação
• Muito sensível
• Larga faixa dinâmica
• Reprodutibilidade
• Quantificável
• Não é mais caro que PCR convencional

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PCR
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Química da fluorescência
SYBR Green
TaqMan
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TaqMan Atividade 5-Nuclease
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(No Transcript)
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A Atividade 5-Nuclease não altera a PCR
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(No Transcript)
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TaqMan usa uma Probe Fluorescente
Reporter
Quencher
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Taq Extende do Primer Upstream
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A atividade 5-Nuclease digere a Probe
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Aumento do sinal do Reporter durante a
Amplificação
Número de ciclos
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SYBR Green I
Corante Minor Groove Binding.
Sem probe Custo mais baixo que TaqMan
Menos que 0.5?g de DNA na amostra.
Não aceita multiplex.
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Especificidade
TaqMan
Alta especificidade, inerente a química.
SYBR Green
Baixa especificidade. Espec. observada apenas
no Melt Curve
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PCR quantitativo
Expressão gênica transgênicos Quant. Câncer Qt
patógenos
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Fases da PCR
Plateau
Linear
Gel EtBr
Log DNA
Geométrica
ciclos
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(No Transcript)
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Fase geométrica
y 2X
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Problemas nas fases linear e plateau
Fase linear
Efeito Plateau
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PCR Qt tradicionais
Uso de competidores
Compartilha mesmos primers.
Competidor tamanhos diferentes.
Compartilhar mesmas condições.
Métodos radio / ELISA.
.
Gráfico conc.
.
.
Limite de número de ciclos.
.
.
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O Que faz o Real Time?
A tecnologia Real Time tem acesso a fase
Geométrica maior qualidade.
São evitadas as fases linear e plateau.
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Calibração externa
DNA/RNA são amplificados como uma curva separada
para compensar a eficiência e fornecer unidades
de quantificação
target A
Detection threshold
target B
Log DNA
ciclos
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(No Transcript)
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Plot da Amplificação
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Curva Padrão
y -3.6x 39 R2 0.999
7 pg DNA
700 ng DNA
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OBRIGADO