Diapositive 1

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POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN
génomique ou - copie d ARNm CDNA
Détection spécifique
Amplification spécifique
Hybridation moléculaire
Amplification in vitro PCR
Clonage dans des vecteurs
- Sonde ADN ou ARN marquée
- vecteur - lier le fragment d ADN au vecteur -
transfert dans lhôte
- polymérase thermostable -information sur la
séquence permettant de générer des amorces
damplification
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LE CLONAGE
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I - Propriétés des vecteurs de clonage

• capables de réplication autonome dans une cellule
  hôte donnée
• (origine de réplication de type procaryotique et/
  ou eucaryotique)
• possèdent un polylinker ou site multiple de
  clonage
• Possèdent des propriétés permettant la sélection
  de la cellule hôte (résistance ATB)
• supportent linsertion dun fragment dADN plus
  ou moins grand

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Différents vecteurs de clonage
Taille maximum approximative du fragment dADN
qui peut être cloné dans chaque vecteur
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(No Transcript)
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II Principes généraux dutilisation dun vecteur
Exemple du plasmide

• Préparation du vecteur
• Préparation de lADN à insérer
• Réalisation dun recombinant
• - Incorporation à lhôte

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Obtention de lADN recombinant
traitement PAL
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La ligation (ligature...)
Une enzyme, la ligase, est capable de lier de
façon covalente deux molécules dADN en une.
Molecular Cell Biology
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II Principes généraux dutilisation dun
vecteur

• Préparation du vecteur
• Préparation de lADN à insérer
• Réalisation dun recombinant
• - Incorporation à lhôte

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Introduction de lADN recombinant dans les
cellules hôtes
Cas dun vecteur plasmidique lADN est introduit
dans les bactéries traitées le plus souvent par
choc électrique.
électroporateur
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Criblage des clones intéressants
1 Sélection des bactéries qui ont incorporé un
plasmide culture sur un milieu qui contient un
ATB
2 Sélection des bactéries qui ont incorporé un
plasmide recombinant test blanc - bleu
Pas dinsertion Gène LacZ Activité
galactosidase BLEU Insertion Gène lacZ Pas
dactivité Galactosidase BLANC
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III - APPLICATIONS DES VECTEURS

• - Clonage et amplification dune séquence dADN
• Création des banques dADN génomiques et dADNc
• Introduction dun gène dans des cellules, des
  plantes ou
• des organismes(animaux transgéniques)
• Production dARN
• - Production de protéines codées par les gènes
  insérés

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Production de protéines humaines à but
thérapeutique

• Facteur VIII de la coagulation dans lhémophilie
  A
• Hormone de croissance
• - Insuline

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Autres exemples
Levures et bactéries utilisées comme usines
production d'antibiotiques (pénicilline,
tétracycline), d'enzymes comme lipases,
lessives... Vaccins fraction de protéines
virales nécessaire à la production
dAC Bioréactifs Enzymes de restriction dimin
ution du coût