Le squenage grande chelle au Genoscope

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• Le séquençage à grande échelle au Genoscope
• Stratégies actuelles et perspectives

P. Wincker, Séminaire INRA, Paris, 06.11.07
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• Status Public Institute
• Mission provide high-throughput sequencing data
  to the French Academic community , and carry out
  in-house genomic projects
• Creation 1997
• Part of the CEA Institut de Génomique since
  05/2007

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Procedures on Scientific Projects

• in house evaluated by the Scientific Committee
• collaborative - proposed by
  external labs (annual call for proposals) -
  evaluated by the Scientific Committee -
  supported by Genoscope's budget
• shared cost - consumables and labor
  supported by applicant - other costs on
  Genoscope's budget - approval by Scientific
  committee gt100 000 reads
• paid services

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Breakdown of sequencing activity since
1998 Total reads 41 681 315
5
Breakdown of sequencing activity in 2006 Total
reads 12 138 976
Coûts partagés 1,4
6
Successful applications since 1998 Total 188
7
Sequence categories
8
Genomes (finished and in progress)
9
(No Transcript)
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Lorganisation du séquençageau Genoscope
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Personnel (01/01/06)

• Mapping
• Libraries, subcloning
• Sequencing template prepping
• Finishing
• Development
• Research projects
• R and D
• Robotics
• Informatics
• Bio-informatics
• QC and QA
• Infrastructure (Kitchen, building etc.)
• TOTAL (FTE)

8 11 18 15 4 27 8 3 21 24 2 9 150
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Niveaux daccès aux capacités du Genoscope par
Appel dOffres
Projet
Séquençage Sanger, 454 (2007), Solexa (2008)
Assemblage, finition, clustering
Annotation procaryote (MAGE)
Annotation eucaryote (GAZE)
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Sélection des projets

• Appel doffres évalué annuellement par un conseil
  scientifique externe (1998-2007)
• A partir de 2008
• Appel doffres (GIS Ibisa)
• Projets ANR (Programme Génomique)

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Sequencing equipment total capacity ABI 3730
19 (30 M bases/day) 454/GSFLX 1 (100 M
bases/day)
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Impact des nouvelles technologies de séquençage
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Evaluation des NTSs au Genoscope

• Qualité des lectures et des assemblages
• Applications fonction de la taille des génomes,
  complémentarité aux autres technologies
• Impact sur lobtention dune séquence finie

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Exemple du séquenceur Roche / 454
18
(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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454 data (flowgram)
Sanger data (chromatogram)
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Evaluation de la qualité des lectures Mapping
des lectures 454 sur la séquence finie
dAcinetobacter baylyi

• 478.961 lectures mappées (soit 99,55)
• 98.200.952 nt alignés contenant 1.451.396
  erreurs (soit 1,48 derreurs)
• Avec Q 20, 790.487 erreurs (8.10-3) et Q 40,
  343520 erreurs (3.10-3)
• Sur les 172.668 lectures mappées à 100, 60.550
  sont sans erreurs (35)

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Position des erreurs dans les lectures 454
26
Position des erreurs par type dans les lectures
454
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Evaluation des assemblages 454

• Deux types dassemblage proposés
• De novo
• Dirigé (en utilisant la séquence dun génome très
  proche)

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Taille du N50 à différentes profondeurs
(assemblage de novo)
29
Taille du N50 à différentes profondeurs (de novo
vs dirigé)
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Erreurs concentrées dans les régions
homopolymériques

• Fonction de la taille de lhomopolymère
• Pour M. agalactiae, couverture de 30x
• si (N)n avec nlt5, taux derreur 1
• si (N)n avec nlt9, taux derreur 5

? Le taux derreur dépend de la fréquence des
régions homopolymériques Ce nest pas une
valeur absolue
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Evaluation des NTSs au Genoscope

• Qualité des lectures et des assemblages
• Applications fonction de la taille des génomes,
  complémentarité aux autres technologies
• Impact sur lobtention dune séquence finie

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De lassemblage 454 au génome fini

• Points positifs
• Pas de clonage ? présence des régions
  incompatibles avec E. coli
• Quasi-insensibilité aux biais compositionnels
• Vitesse une semaine de lADN à la séquence
• Points négatifs
• Pas de liens entre séquences ? pas de
  supercontigage
• Taux derreur élevé dans les homopolymères
• pas dassemblage des séquences répétées

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Microbial Genome Sequencing

• Until December 2006 12x coverage with Sanger
  technology, 3 libraries (insert sizes 3 kb, 10
  kb, 40 kb)
• From january 2007 4x Sanger coverage, single
  library (10 or 40 kb) 20x coverage GS20 reads
• Assembly with Arachne (Broad Institute) using
  Sanger reads and Newbler contigs
• From June 2007, 4x Sanger coverage, single
  library (10 or 40 kb) , 15x coverage GSFLX
  reads
• Assembly with Arachne (Broad Institute) using
  Sanger reads and Newbler contigs or with Newbler2
  using Sanger reads and GSFLX reads

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Le séquenceur Solexa / illumina 1G
Amplification directe sur lames (pas de PCR en
émulsion) Séquençage par terminateurs
reversibles Longueurs de lecture 25-35
bases Débit 40 000 000 lectures / run
35
Applications du Solexa/Illumina 1G (ou ABI Solid)

• SNP detection
• ChIp-Seq
• Quantitative / qualitative transcriptomics
• small RNAs

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Méthodes pour le re-séquençage environnement
informatique

• Objectif aligner chaque lecture à une
  localisation unique (si elle existe) sur le
  génome de référence
• Exemple si utilisation de blast
• 1 lecture contre 140Mb (chr9 humain) 18s/CPU
• 1 lecture contre 3Gb 386s/CPU
• 1Gb lectures Solexa contre 3Gb 490 années/CPU
• 20x de lectures Solexa contre 3 Gb 44.000
  années/CPU
• Nécessité dutiliser des méthodes différentes
  qui tiennent compte de la petite taille des
  lectures
• phageAlign compare chaque lecture avec les
  k-mers génomique (en triant les k-mers et en
  exploitant les parties communes des préfixes pour
  réduire le travail)
• ELAND place les lectures dans une structure de
  données et les aligne toutes en même temps

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Perspectives dutilisation Solexa / Illumina 1G

• Small RNAs, tags avantage de coût par rapport
  au 454/Roche
• Séquençage de génomes attente du développement
  dassembleurs adaptés
• Amélioration de la qualité des séquences
  454/Roche assemblés

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Notions de coût par base (ordre de grandeur)
Sanger (ABI3730xl) 1000 euros / Mbase ? taux
derreur lt 99, assemblage de qualité à 10
équivalents, supercontigage
immédiat Roche/454 GSFLX 100 euros /
Mbase ? taux derreur gt 1 dans les régions
homopolymériques, assemblage de qualité à
20 équivalents, pas de supercontigage Illumina
1G lt10 euros / Mbase ? taux derreur lt99.9
, pas dassemblage de qualité
39
4x
15x
0.5x
10-100x
Assemblage, finition
Assemblage, finition

15x
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Evolution accélérée des NTSs

• Roche / 454
• 2006 20 Mb par run (100 bases par lecture)
• 2007 100 Mb par run (250 bases par lecture)
• 2008 1 Gb par run (500 bases par lecture)

• Solexa/Illumina 1G
• 2007 1 Gb par run (32 bases par lecture)
• 2008 3 Gb par run (50 bases par lecture,
  lectures en paires)

? Difficile de prévoir quelle technologie sera
utilisée pour séquencer un génome dans 1-2
ans
41
Vers un séquençage génomique à très bas coût

• Dépendra de la capacité à assembler des séquences
  courtes et peu chères
• Développement de lectures paired-ends ?
• Allongement des longueurs utiles de type Solexa ?
• Baisse des coûts des lectures 454 ?
• Amélioration spectaculaire des logiciels
  dassemblage ?
• Arrivée dune nouvelle technologie ?

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Une perspective très mobile

• Les programmes de comparaison multi-génomes
  devraient se généraliser
• La métagénomique connaîtra un développement
  exponentiel
• De nombreux projets jugés jusqualors trop
  coûteux deviennent réalisables
• Mais toutes ces perspectives nécessitent des
  progrès pour être envisageables pour des génomes
  de grande taille

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Une perspective très mobile

• Les technologies utilisées peuvent devenir
  caduques très vite
• Les besoins informatiques augmentent
  considérablement
• Risque denvahissement par des données massives
  de faible qualité

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• Director J. Weissenbach
• Sequencing coordination P. Wincker
• Production Sequencing J. Poulain
• Roche / 454 development C. Cruaud
• Informatics C. Scarpelli, V. Vico, V. Anthouard,
  J. Leseaux
• Assembly J.M. Aury

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(No Transcript)