Transmission dinformation gntique

1
Transmission dinformation génétique
La Transmission verticale la mutation
spontanée, induite, la transposition La
fréquence de mutation sur 1 nucléotide chez E.
coli est de lordre de 10-9 (taille du génome de
lordre de 106 pb), il faut donc 103 cellules
pour observer une erreur aléatoire dans un
génomealors dans une colonie?

• La Transmission horizontale Elle est
  unidirectionnelle et passe souvent par la
  recombinaison homologue.
• Les 3 moyens d'échange génétique pratiqués par
  les procaryotes (transformation, conjugaison et
  transduction) font appel à la recombinaison
  homologue.
• La recombinaison homologue chez les eucaryotes
  se manifeste principalement au cours dune
  division particulière, la méiose, chez les
  bactéries celle-ci peut avoir lieu tout le long
  du cycle cellulaire.
• La compréhension de la recombinaison homologue
  est essentiellement basée sur les travaux
  effectués chez E. coli.

2
La Recombinaison homologue

• La recombinaison génétique est le concept de base
  utilisé pour la localisation de mutations (et par
  extension de gènes).
• Cassure et jonction de nouvelles séquences sont
  en partie responsables de la diversité génétique
  observée chez les procaryotes.
• Ex. A--B et a--b donne A--b et a--B après
  recombinaison.
• La recombinaison homologue seffectue entre
  séquences dADN identiques ou quasi identiques
  dont la longueur dhomologie chez E. coli peut
  être aussi courte quune 30aine de pb.
• Elle requiert la mobilisation de produits de
  nombreux gènes pour résoudre ce que vous
  connaissez sous le terme de crossing-over.

3
La Recombinaison homologue, les étapes

• Cassure dADN
• Recherche dhomologie et initiation
  dappariement, étape clé gérée par le produit du
  gène recA
• Modèle des jonctions de Holliday
• Migration des jonctions de Holliday, extension de
  la zone de recombinaison
• Résolution
• Les intervenants protéiques sont extrèmement
  nombreux à chaque étape et cest la coordination
  de tous les évènements qui aboutit à léchange
  génétique.
• Les mécanismes de recombinaison homologue sont à
  la fois responsables du maintien de linformation
  génétique (outils de réparation) et sources de
  variation de linformation.

4
Modèle de recombinaison homologueIllustration
KowalczykowskiTIBS 25 april 2000, p156
5
La Transformation

• Processus permettant la capture dADN exogène nu
  par une bactérie et son incorporation au génome
  de celle-ci.

La capacité à transformer est en général
transitoire. Létat physiologique permettant à la
bactérie de capter lADN est appelé état de
compétence.
Cest un mécanisme très répandu dans le monde
bactérien aussi bien chez les Gram positif que
négatif. Historique Griffith 1928 Avery et
Mc Leod 1944
6
La transformation ex, le pneumocoque

• La bactérie Streptococcus pneumoniae Diplocoque
  à Gram positif
• Niche Nasopharynx chez l'homme, 1 individu sur 2
  est porteur sain
• Pathogène, provoque principalement des
  pneumonies, des otites, méningites...
• Représente aux USA environ 500000
  hospitalisations et 40000 décès,
• en France environ 10000 décès. 1ère cause de
  mortalité par infection chez lenfant, 1ère cause
  de méningite et de surdité acquise chez lenfant
• Cibles privilégiées enfants, personnes agées et
  individus ayant leur système immunitaire affaibli
  (un fumeur aurait un risque augmenté d'un facteur
  4)

7
La transformation ex, le pneumocoque

• Particularités Possède une capsule
  polysacharidique le protégeant du système
  immunitaire avec une variabilité importante,
  environ 90 sérotypes répertoriés.
• Capable de capturer de l'information génétique
  exogène via un système génétique programmé qu'est
  la Transformation génétique naturelle. De ce
  fait, cette bactérie possède une grande
  plasticité génétique.
• La transformation est à la base de l'émergeance
  rapide de clones résistants aux antibiotiques

8
Étapes de la transformation
9
Étapes de la transformation
10
Entrée de LADN, aspect Mécanistique
(Lacks et al., 1975 Morrison et Guild, 1973
Méjean et Claverys, 1988 Bergé M., Moscoso M,
et al 2002 pour revue Dubnau, 1999.)
11
Approche expérimentale

• Comment la bactérie sapproprie-t-elle
  linformation exogène?
• Y a-t-il échange physique par recombinaison
  homologue ou bien l'information est-elle recopiée
  sur le génome sans incorporation de la molécule
  exogène?
• Vincent Méjean and Jean Pierre Claverys J.
  Bacteriol. 1984 Vol 158 N3 1175-1178
• Mise en Place de l'expérimentation
• - plasmide pR6 d'E. coli contenant un fragment
  d'ADN PstI/EcoRI chromosomique de Sp de 5.7 kpb.

12
Suivi du devenir de lADN stratégie
expérimentale
13
Profil de radioactivité après Southern
L'information de l'ADN exogène est bien intégrée
par recombinaison homologue puisqu'on retrouve la
radioactivité liée de manière covalente aux
fragments de restriction. La dispersion à
travers l'ADN génomique de la radioactivité
montre qu'il existe aussi une dégradation et un
recyclage des nucléotides appartenant à cet ADN
exogène.
Pour l'ADN non digéré, un pic important d'ADN de
haut poids moléculaire, cela implique que l'ADN
radioactif exogène est intégré de manière
covalente dans le chromosome.
14
Devenir de lADN internalisé
(Méjean et Claverys, 1984)
ADN radioactif internalisé
chromosome
15
Suivi de lADN
(Méjean et Claverys, 1984)
Si l'on a réincorporation des nucléotides
recyclés après dégradation de l'ADN donneur au
cours de la réplication, alors en bloquant la
réplication, on devrait supprimer cette
incorporation aléatoire dans le génome.
ADN radioactif internalisé
Recombinaison
chromosome
16
Suivi du devenir de lADN stratégie
expérimentale
17
Sous quelle forme lADN entre dans la bactérie ?
6.6 kb
2.3 kb
0.56 kb
Lutilisation de la nucléase S1 spécifique de
lADN simple brin permet de révéler que lADN
entrant, avant son incorporation par
recombinaison homologue, est sous forme simple
brin.
1 min
5 min
15 min
18
Polarité dentrée

• Existe-t-il une polarité d'entrée de l'ADN simple
  brin, comment l'observer ?
• Vincent Méjean and Jean Pierre Claverys Mol. Gen.
  Genet. 1988 213, 444-448
• Expérimentation
• Utilisation du bactériophage M13, polymérase,
  dNTP radioactifs et froids, enzyme de restriction
  et purification des molécules désirées.
  Obtention de différents substrats

19
Polarité dentrée
3
3
5
5
3
5
3
5
540 cpm
20190 cpm
LADN entre 3 en tête
20
Recombinaison RecA dépendante

• Martin,B. Ruellan,J.M. Angulo,J.F. Devoret,R.
  Claverys,J.P. 1992 Nucl.Acids Res. 20 6412
• Martin,B. Garcia,P. Castanié,M.P.
  Claverys,J.P.1995 Mol.Microbiol.15 367-379
• Question par quel mécanisme cet ADN simple brin
  est-il recombiné dans le génome? Est-ce qu'il
  existe un système de recombinaison homologue recA
  dépendant similaire à celui de E.coli?
•  
• Mise en place de la recherche d'un équivalent de
  RecA d'E.coli.
• Isolement d'un gène homologue par recherche
  anticorps croisée.
• Quel est le comportement d'un mutant recA nul en
  transformation?
• Ne transforme pas

21
Recombinaison RecA dépendante

• Question ne rentre pas ou bien ne recombine pas?
• Expérimentation
• ADN donneur radioactif cellule compétente en
  parallèle sur wt et recA
• Résultats interprétations
• Mesure de l'entrée en radioactivité
• Dpm/bactéries 3.3 10-4 pour wt et 3.5 10-4 pour
  recA
• Mesure du taux de transformants Smr chromosomique
• 1.8 106/ml (3) et lt10/ml pour recA
• Dans le mutant recA, l'ADN entre comme dans le
  wt, recA est donc impliqué dans la dernière
  partie de la transformation, la recombinaison
  homologue.

22
La conjugaison

• Une remarquable propriété de bien des plasmides
  est de posséder linformation génétique leur
  permettant de se transférer dune cellule à
  lautre cest la conjugaison.
• Observée pour la 1ère fois en 1947 par Lederberg
  et Tatum chez E. coli.
• La conjugaison est un mécanisme unidirectionnel
  avec une bactérie donneuse et une bactérie
  réceptrice.
• Parfois les plasmides conjugatifs participent à
  la mobilisation du chromosome ou dautres
  plasmides.
• Les plasmides conjugatifs peuvent être classés
  selon leur mode de réplication (groupe
  dincompatibilité) et aussi selon leur mécanisme
  de transfert (gènes tra).
• Beaucoup de plasmides dits  à large spectre
  dhôte  sont capables détablir des transferts
  inter-espèces mais aussi inter-royaumes.

23
Mécanisme de conjugaison

• Cf petit film
• 2 étapes importantes  réplication de
  linformation et transport de lADN.
• Contact cell-cell ensemble de protéines
  constituant un système de sécrétion de type IV
  chez les Gram- formant un canal
  trans-membranaire.
• Le complexe ADN-protéine chargé de la réplication
  
• Cassure simple brin au niveau doriT (différent
  de oriP)
• Déplacement par une hélicase du brin cassé
• Passage dans la cellule réceptrice et
  recircularisation du brin
• Synthèse des brins complémentaires.

24
Transfert du chromosome par conjugaison

• Cf petit film
• Formation dHfr ( linsertion du facteur F
  recombinaison homologue entre IS et formation de
  cointégrat via des événements de transposition).
• Un chromosome peut être aussi mobilisé si
  celui-ci possède une oriT.
• Facteur prime  insertion dADN chromosomique
  dans le plasmide conjugatif
• (ex  à partir dun Hfr, une recombinaison
  homologue peut avoir lieu entre 2 IS répétées
  directement entourant linsertion du F, donnant
  ainsi un F)
• Ces événements jouent un rôle certain dans
  lévolution puisque des gènes peuvent être
  échangés entre espèces éloignées
• Historique  E. coli
• Les outils génétiques dérivés du mécanisme 
• La cartographie génome circulaire
• Le Mating out

25
Détermination génétique de la transmissibilité
dun plasmide

• Pour observer un transfert il faut éliminer les
  donatrices et les réceptrices pour ne conserver
  que les réceptrices ayant reçues le plasmide.
• Contre-sélection de la réceptrice il faut que
  le plasmide possède un marqueur de sélection que
  na pas la réceptrice. Si le Plasmide ne possède
  pas un gène sélectionnable, il faut en introduire
  un.
• Contre-sélection de la donatrice  il faut que la
  réceptrice possède un marqueur de sélection que
  na pas la donatrice (ex une résistance
  chromosomique).
• Choix de la cellule réceptrice crucial  proche
  de la donatrice pour éviter des problèmes de
  restriction, de réplication du plasmide et
  dexpression du gène de sélection.
• La manipulation consiste à étaler la donatrice,
  le mélange, et la réceptrice, seul le mélange
  devrait donner des colonies sur milieu double
  sélection.

26
La conjugaison chez Enterococcus faecalis un
exemple de communication bactérienne

• G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides
  22 1529-1539
•  
• Cela fait bientôt 30 ans que lon a isolé le
  plasmide conjugatif pCF10 conférant la résistance
  à la tétracycline chez E. faecalis.
• Isolé à partir dune infection nosocomiale, il a
  été à nouveau isolé du même hôpital mais cette
  fois avec une résistance à la vancomycine, un des
  derniers antibiotiques rempart contre les
  bactéries pathogènes ou opportunistes.
• Cela signifie que ce plasmide a voyagé parmi les
  entérocoques acquérant différents Transposons
  responsables de ces nouvelles résistances.

27
La conjugaison chez Enterococcus faecalis un
exemple de communication bactérienne G. Dunny M
Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22
1529-1539
PrgZ Présente cCF10 à Opp
PrgX Répresseur Des fonctions de conjugaison
28
Comment la cellule réprime linduction de cCF10
?G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001
Peptides 22 1529-1539
La cellule ayant reçu le plasmide va réprimer
lauto-induction par cCF10 en synthétisant un
peptides iCF10 qui excrété va neutraliser cCF10
et une protéine PrgY qui, associée à la paroi
empêche le cCF10 piégé dans la paroi dinteragir
avec PrgZ.
Ces 2 éléments étant juste suffisants à
contre-carrer la production de la cellule, toute
cellule dépourvue de ce plasmide et donc
productrice de cCF10 fera basculer en induction
de conjugaison la cellule donatrice.
29
Synthèse de la phéromone cCF10 G. Dunny M
Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22
1529-1539
Ces phéromones agissent à des concentrations très
faibles, (10-11 à 10-12 M). Elles sont très
hydrophobiques et par conséquent peu solubles
dans les milieux aqueux.
 Lanalyse de la séquence du génome de E.
faecalis a permis didentifier le gène supposé
coder la phéromone. La prédiction est le codage
dune lipoprotéine qui est ancrées dans la
membrane grâce à une séquence NH2 terminale. Pour
cela il faut cliver sa séquence signal qui est
excrétée au moment de la translocation de la
lipoprotéine dans la membrane contient la future
phéromone. Cest le clivage de celle-ci par une
protéase au niveau de la paroi qui libère cette
phéromone qui se retrouve pour lessentiel piégée
dans la paroi.
30
Conjugaison chez les Streptomyces
31
Transposon conjugatif ou ICEBurrus, Pavolovic,
Decaris et Guédon molecular Microbiol. 2002 vol
46 p601-610

• Hybride entre les transposons à recombinaison
  spécifique de site et plasmide conjugatif
  dépourvu doriP.
• Le plus connu est Tn916 isolé aussi chez E.
  faecalis. Ces éléments sont actuellement
  répertoriés et semblent très répandus dans le
  monde bactériens.
• Appelés ICEs pour Integrative and Conjugative
  Elements. La très grande majorité dentre eux
  font tous appel à un système de recombinaison
  site spécifique pour leur intégration.
• Note pCF10 doit sa résistance à la tétracycline
  par lintégration de Tn925 qui est un ICE dans le
  plasmide conjugatif dorigine..

32
Le monde des bactériophages
Tout virus de bactérie est appelé bactériophage
ou phage.
Comme tous les virus, les phages sont des
organismes parasites obligatoires possédant une
information génétique codée soit en ADN ds 
ADNss ou ARN enveloppé dans des protéines et ou
dans une membrane de protection. Lacide
nucléique doit comporter au minimum une copie du
génome du phage. Visible uniquement en
microscopie électronique, on ne les détecte à
lil nu par les  trous  ou plages de lyse
quils créent sur des tapis bactériens
hôtes. Les phages peuvent être répertoriés selon
leur mode de multiplication, en Cycle lytique et
Cycle lysogénique. Dans le premier cas, le phage
tue son hôte pour se multiplier, dans le deuxième
cas, il reste à létat dormant et se multiplie en
même temps que son hôte sans le tuer.
33
Le monde des bactériophagesEx  N. Mann, FEMS
Microbiology review 27 (2003) p17

• La place des bactériophages dans le monde vivant
  est à prendre en compte.
• Les cyanobactéries comme Synechococcus et
  Prochlorococcus sont responsables de 32 à 89 de
  lapport oligotrophique dans les océans et de 50
  de loxygène que lon respire.
• Ces bactéries sont présentes en moyenne à 106/ ml
  deau de mer. Cependant on estime que les
  bactériophages sont 10 x plus nombreux.
• Au cours de lannée la répartition des
  cyanobactéries dans une région, tant en
  profondeur quen quantité, varie énormément et
  semble corrélée à la multiplication de certains
  bactériophages.
• Ceux-ci possèdent en plus de leur information
  génétique des gènes participent à la
  photosynthèse, pouvant ainsi influencer la survie
  de la population bactérienne

34
Les cycles
Cycle lytique état de virulence
Cycle lysogénique état dormant
35
La transduction

• Généralités
• On peut observer lors de la multiplication dun
  phage, lencapsidation dinformation génétique de
  la bactérie infectée.
• Cet ADN peut être un segment de chromosome, un
  plasmide (qui peuvent eux même contenir un EGM).
  Cest cette particule qui peut jouer le rôle de
  navette et transduire linformation quelle porte
  à une autre bactérie.
•  
• On peut distinguer la transduction généralisée
  (fragment dADN encapsidé de manière aléatoire)
  de la transduction spécialisée (seules quelques
  gènes à proximité du phage intégré peuvent être
  encapsidés).
•  

36
La transduction

• La transduction est un phénomène rare et cela
  pour plusieurs raisons 
• lerreur dempaquetage dans la capside est un
  événement peu fréquent.
• La probabilité que cette particule infecte seule
  une bactérie réceptrice est faible
• Cet ADN injecté doit survivre suffisamment
  longtemps pour former un transductant stable
  (échapper aux endo et exonucléases, et
  sinstaller par recombinaison ou transposition
  ou par réplication autonome )
• Quest ce qui fait quun phage peut être
  transductant?
• Il ne doit pas dégrader entièrement lADN de
  lhôte. Les motifs ADN dempaquetage ou sites Pac
  (Packing) ne doivent pas être trop spécifiques.

37
La transduction
Généralités Le phage P1, outil génétique de
transduction Il possède un large spectre dhôte
chez les Gram négatif et son site Pac fait partie
des moins spécifiques. Il empaquète en moyenne
dans les capsides un ADN chromosomique pour 100
ADN phagiques. La taille empaquetée est
denviron 90 kpb. T4 na pas de site Pac mais
ne peut transduire que si on inactive son enzyme
de dégradation de lADN hôte. Lambda est un très
mauvais transducteur car lempaquetage se fait
entre 2 sites COS plutôt que par empaquetage en
tête... La transduction peut jouer un rôle non
négligeable dans lévolution bactérienne en
transfert horizontal même si la fréquence de
transfert semble être plus aléatoire que la
transformation et la conjugaison.
38
La transduction
La transduction reste encore un outil pour la
génétique, pour la cartographie, le transfert
dallèle et la construction de souches (même si
de nombreuses autres techniques apparaissent)
  Le transfert dADN bactérien via une capside
de phage ceci comprend linjection et la
recombinaison homologue dans la cellule
réceptrice. La taille de lADN transféré est en
général assez courte car conditionnée par la
capacité à être encapsidé par le phage.   La
M.O.I. (multiplicity of infection) joue un rôle
important dans la transduction. Du fait du faible
taux de particules transductrices, il faut
réduire au maximum la double infection de
cellules. Il faut aussi prévenir le deuxième
cycle dinfection qui risque dêtre fatal au
transductant. Ces 2 paramètres étant maîtrisés,
on peut envisager dutiliser les phages comme
outils en génétique.  
39
La transduction M.O.I.
40
La transduction de marqueur génétique
Sélection des bactéries recombinantes ou
transduites
41
La transduction de marqueur génétique
ADN chr

42
Cartographie par cotransduction
m1
Fragment ADN chr
ADN chr
m1 et m2 ne pourront jamais être injectés par un
même phage transducteur dans la cellule et donc
recombinés dans la même cellule.
Après transduction et sélection de transductant
ayant acquis m1, la fréquence de m3 parmi les m1
sera plus importante que m4 parmi les m1 La
fréquence de cotransduction sera dautant plus
importante que ces marqueurs seront proches.
43
Cartographie de 3 marqueurs par analyse des
fréquences de cotransduction.
Comment ordonner 3 marqueurs qui cotransduisent ?
argH et rif 37 de cotransduction
argH et metA 20 de cotransduction
rif et metA 80 de cotransduction
On en conclue que lordre est arg rif metA
44
Cartographie 3 marqueurs par fréquence
dévènements de recombinaison
Donneuse (arg met- rifr) et réceptrice (arg-
met rifs), sélection arg et test pour les
phénotypes met et rif. La catégorie la moins
représentée nécessite 4 recombinaisons alors que
toutes les autres nen nécessitent que 2. Cela
est vrai seulement si le marqueur de référence
transduit nest pas central. Arg met
rifr 61 Arg met rifs 22 Arg met-
rifr 2 Arg met- rifs 15
A-
Ordres possibles
A-
M
M
Rr
A-
M
Rr
Rr
Événements de recombinaison possibles
1
2
3
4
Evénements de recombinaison requis pour avoir les
phénotypes transductants
Arg met rifr 14 14 14 Arg met
rifs 13 1234 13 Arg met-
rifr 1234 13 24 Arg met-
rifs 12 12 23
45
La régulation transcriptionnelle chez les
bactéries

• La transcription par lARN polymérase dune
  région dépend du motif de reconnaissance et de
  son accessibilité

Motif de reconnaissance par lARN polymérase
Nature \ 417, 712 - 719 (13 June 2002) crystal
structure of a bacterial RNA polymerase
holoenzyme from Thermus thermophilus
46
La régulation transcriptionnelle chez les
bactéries

• Evidence génétique de régulation positive ou
  négative.

Régulateur trancriptionnel
Régulateur positif perte de fonction phénotype? R
égulateur négatif perte de fonction phénotype?
Les mutations constitutives sont plus fréquentes
pour les régulateurs
47
La régulation transcriptionnelle chez les
bactéries

• La complémentation révèle en général une
  différence supplémentaire pour les mutants
  constitutifs entre une régulation positive et
  négative

R wt
R mutant
Une mutation constitutive dans le cas dune
régulation négative est en général récessive par
rapport à la forme allélique sauvage.
Une mutation constitutive dans le cas dune
régulation positive est en général dominante par
rapport à la forme allélique sauvage.
48
La régulation négative de l'opéron lactose

• Si l'on fait pousser Escherichia coli dans un
  milieu contenant uniquement du lactose comme
  seule source de carbone et d'énergie, on voit que
  la bactérie produit une enzyme spécifique de
  l'utilisation de ce substrat la
  b-galactosidase, alors que cette dernière n'est
  pas détectée sur un milieu contenant une autre
  source d'énergie (de 0 à 1000 fois plus).
• Ceci est également vrai pour les autres
  substrats carbonés tels que l'arabinose, etc..
  excepté le plus simple à "intégrer" dans les
  différents cycles énergétiques, le glucose.
• Il existe une réponse adaptative de la bactérie.
• La b-galactosidase n'étant induite qu'en
  présence du lactose (inducteur).

49
Comment la bactérie peut-elle savoir précisément
quel enzyme synthétiser?

• F. Jacob et J. Monod ont obtenu deux type de
  mutants.
• des mutants lac- dans la région ZY et aussi
  dans la région lacI
• des mutants lac dans la région I qui avait
  pour caractéristique d'être constitutif (les
  gènes ZYA sont tout le temps exprimés)
• Ils ont montré que cette région I contrôle
  l'inductibilité des gènes ZYA. Ce contrôle ce
  fait par l'intermédiaire d'une protéine I
  diffusible ayant la capacité de réprimer la
  transcription de ZYA.

50
Test de complémentation

• Notion de mérodiploide

m2
m1
51
Mutations lac- récessives
I
P
O
Z-
Y
A
inducteur
I
P
O
Z
Y-
A
52
Mutations lac- récessives avec action en Cis

• Les mutations récessives qui ne peuvent pas être
  complémentées affectent en général un site ADN
  plutôt quun produit de gène diffusible.

I
P-
O
Z
Y
A
X
X
ARN pol
X
I
P
O
Z-
Y
A
53
Mutations lac- dominantes

Is
P
O
Z
Y
A
X
inducteur
I
P
O
Z
Y
A
54
Mutations récessives constitutives

I-
P
O
Z
Y
A
X
X
I
P
O
Z
Y
A
55
Mutations dominantes constitutives avec action en
trans

Id
P
O
Z
Y
A
X
X
X
I
P
O
Z
Y
A