Scurit et cytomtrie en flux

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Sécurité et cytométrie en flux
Formation permanente Marseille 23 novembre 2007
Gérald Grégori
Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et
Ecologie Marines CNRS UMR 6117 163 Avenue de
Luminy - Case 901- Bât TPR1, 13288 Marseille
cedex 9 Tél. [phone] Fax (33)
4.91.82.96.41 Contact gerald.gregori_at_univmed.fr
Adapté du Cours de Cytométrie organisé dans
le cadre du congrès ISAC (Québec, 2006) par G.
Grégori et L. Krebs (Elly Lilly, USA)
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Les risques

• Risques biologiques
• Risques électriques
• Irradiation par les LASERS

Source http//www.compliancesigns.com/
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Risques biologiques
Risques biologiques
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Sources communes de risques biologiques en
cytométrie en flux

• Echantillons frais (non fixés)
• Matériel humain ou animal (singes, porcs)
• Vecteurs viraux pour transfections génétiques
• Transmission de maladies entre espèces
• Pathogènes résistants aux traitement
• OGM
• Certains virus carcinogènes (hépatite)

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Fausses idées préconçues

• Le matériel non humain/primate ne présente pas de
  risque
• Les échantillons préparés pour les analyses de
  virus HIV ou Hépatite, autres maladies sont
  sûrs
• Les cellules issues de cultures ne présentent pas
  de risque
• Impossible dobtenir un soutien institutionnel
  pour améliorer les procédures de manipulation des
  échantillons

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Le risque induit par les aérosols générés lors du
tri (buse Jet-in-air)

• Génération de gouttelettes Normales
• Petites (40-200µm)
• Micro (3-7µm)
• Le splash dans le réceptacle pour la collecte
• Problème instrumental (bouchage)
• Tri à haute vitesse / haute pression augmente le
  risque

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Les aérosols Source de risque élevé

• Quand risque dinfection potentiel
• Niveaux plus élevés de confinement
• Multiples barrières secondaires
• pour empêcher le dispersion et la propagation
  dans lenvironnement

Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories Fourth Edition April 1999
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Questions sur les risques biologiquesISAC 2005
Surveillance Committee Survey

• Tri à haute vitesse dans 85 des labos
• 65 des tris dans labos standards
• lt10 des tris se font en BioSafetyLevel (BSL) 3
• 67 des labos ne mesurent pas la présence
  daérosols
• Seulement 21 des tris nécessitent une formation
  particulière pour du matériel potentiellement à
  risque
• Seulement 50 des labos utilisent un
  questionnaire pour identifier la nature et le
  risque des échantillons avant daccepter le tri.

J.Lannigan Communication Ingrid Schmid, UCLA,
Chair, ISAC Biosafety Committee
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Dépôts potentiels des aérosols
Sourcewww.cdc.gov/niosh/topics/aerosols
(Aerosols 101)
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Risque relatif

• Tous les échantillons ont un niveau de risque
• Les manipulations doivent être appropriées au
  risque
• Risque faible échantillons fixés
• Risque faible à modéré lignées cellulaires
  non-humaines/primates et non manipulées (BSL1)
• Risque élevé lignées cellulaires
  humaines/primates, manipulées génétiquement ou
  cellules infectées (BSL1/2)
• Risque le plus élevé matériel primaire
  humain/primate (BSL2), cellules infectées (BSL3)

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Eléments de confinement

• Equipement Barrière primaire
• Laboratoire Barrière secondaire
• Management du labo pratique

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Equipement de sécurité

• Equipement personnel de protection
• Hotte de protection (Biosafety Cabinet (BSC))
• Confinement des aérosols

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Equipement de protection personnel

• Vêtements (blouse)
• Gants
• Protection faciale (lunettes et masque)
• Appareil respiratoire

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Confinement daérosolsau niveau du cytomètre
Trieur MoFlo (DAKO)
Trieur FACSAria (BD)
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Confinement daérosolsau niveau du cytomètre
FACStar Plus FACSVantage SE
Source Cytek Development website
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Eléments de confinement

• Equipement Barrière primaire
• Laboratoire Barrière secondaire
• Protection de lopérateur
• Protection des autres membres du laboratoire
• Protection de lextérieur du laboratoire
• Management du labo pratique
• Questionnaire sur la nature des échantillons
• Traçabilité des échantillons
• Formation du personnel
• Zones à accès règlementés
• Bonnes pratiques de laboratoire (pipetage,
  nettoyage, etc.)
• Gestion des déchets javelliser les déchets
  fixer les échantillons (Formaldéhyde)
• Tests/détection de contamination
• Procédure de décontamination si besoin (Péroxide)

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Choc électrique
Electrical Shock
Source http//www.compliancesigns.com/
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Plaques électriques des trieurs électromagnétiques

• Courant 10µA (3X inférieur au seuil de
  dangerosité humaine)
• Voltage 0-4000 V Courant alternatif

Source www.dakousa.com
Source MoFlo Owners Handbook
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Choc électrique Arc électrique des trieurs
électromagnétiques

• Génération dun arc résulte de plaques
  électriques humides
• Parade
• Arrêter lalimentation des plaques
• Enlever les plaques et les sécher
• Remonter les plaques, reprendre le tri

Source www.scienceclarified.com Illustration of
electric arc between two metals. Reproduced by
permission of Photo Researchers, Inc.
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Choc électrique issu de la charge du jet

• Les trieurs appliquent une charge électrique au
  jet pour dévier les gouttelettes à trier
• Charge 200 V Courant alternatif
• Charge au niveau de la
• chambre de flux

Source www.dakousa.com
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Choc électrique au niveau du cristal
piézoélectrique

• Charge sur le cristal Piézoélectrique 135 V AC

Source www.cytopeia.com
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Irradiation par les lasers
Irradiation Laser
Attention
Source http//www.compliancesigns.com/
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Le terme LASER est un acronyme

• Light Amplification by Stimulated Emission of
  Radiation

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(No Transcript)
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Lumière monochromatique

• Lumière généralement monochromatique (longueur
  donde unique) au contraire dautres sources
  lumineuses (soleil ampoules)
• Lumière émise dans lUV, le visible, et
  linfrarouge
• Certains lasers émettent plusieurs longueurs
  dondes.

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Irradiation par LASER
Brûlures (le plus généralement) À lexception
de quelques situations particulières les brûlures
de la peau sont moins graves que celles de loeil
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Collimation (Parallélisme) de la lumière

• Photons des Lasers cohérents ( parallèles )
• Lil focalise la lumière en un point
• Focalisation des photons ? risque potentiel pour
  la rétine
• La lentille de loeil augmente la puissance par
  unité de surface (W/cm2) de la lumière des LASERS
  par 100 000 fois

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Dommages de loeil

• Thermique
• oedème, hémorragie
• Photochimique (lumière bleue UV)
• Production de toxines modifications
  biochimiques ? inflammation, lésions opacité
• Photo-accoustique (impulsions courtes et
  intenses)
• explosion induite par lexpansion de gaz

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(No Transcript)
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Comment les lasers ciblent les différentes
structures de loeil
lt 400 nm
400 - 1400 nm
Rétine
gt 1400 nm
Lentille
Cornée
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Risques majeurs sur la rétine

• Lumière Laser entre 400-1400nm (risque pour la
  rétine) intensifiée par 100 000 X par leffet
  lentille de loeil.
• Focalisation sur la macula, la région la plus
  sensible et la plus importante de la rétine.
• Cécité partielle (lumière directe ou réflexion).

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Exemple Laser Argon

• ? 488 nm et 514 nm (visible)
• Laser continu
• Puissance de sortie 700 mW
• Classe 4
• Organe ciblé rétine
• Dommage thermique

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Exemples de dommages induits par Laser
Brûlure sur rétine
Source Laser-Professionals.com
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Résumé des longueurs donde à risque pour les
structures de loeil
100
315
400
200
700
1400
3000
Lentille
Rétine
Lentille
Cornée
Cornée
Photochimique
Thermique
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Most cytometer lasers are Class Iwith coverings
interlocks operative
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Classement des Lasers
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(No Transcript)
38
(No Transcript)
39
(No Transcript)
40
(No Transcript)
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Exemple de lasers sur cytomètres
analyseurs-trieurs

• DAKO MoFlo Laser Options
• Solid-State Lasers
• 635nm, 25mW diode
• 488nm, 200 mW diode
• Air-Cooled Laser
• Melles Griot HeNe 25mW, LHP 928
• Water-Cooled Lasers from Coherent
• Enterprise II 621, 488 UV
• Innova 70-2W, Argon
• Innova 70-3W, Argon
• Innova 70-4W, Argon
• Innova 70-5W UV, Argon
• Innova 70-5W, Argon
• Innova 70K, Krypton
• Innova 70-Spec, Argon
• Innova 70-Spec UV
• Innova 90C-3W
• Innova 90C-4W
• Innova 90C-4W UV

Source www.dakousa.com
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Autres risques LASER

• Choc électrique (voltage élevé
• Exposition chimique
• Matériel cryogénique
• Gaz comprimé
• Explosions
• Contamination de lair