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Etude des connexines et analyse de l'activité des
jonctions communicantes par la technique de FRAP
de cellules saines et cancéreuses.
Muriel Abbaci1, Jean-René Stines1, Jacques
Didelon1,Walter Blondel 2, Dominique Dumas3,
François Guillemin1 1 CRAN-UMR CNRS 7039, Centre
de Recherche en Automatique de Nancy CAV,
Centre Alexis Vautrin,Vandoeuvre (France) 2
CRAN-UMR CNRS 7039, Centre de Recherche en
Automatique de Nancy INPL, Institut National
Polytechnique de Lorraine,Vandoeuvre (France) 3
LEMTA-UMR CNRS 7563 et équipe IFR 111,Laboratoire
de mécanique et ingénierie cellulaire et
tissulaire, Plateau Technique dImagerie
Cellulaire, Faculté de médecine,Vandoeuvre
(France)
INTRODUCTION La communication inter-cellulaire au
sein dun organisme multicellulaire est assurée
par les jonctions communicantes. De nombreux
types de cancer sont caractérisés par une
diminution du nombre et de la fonctionnalité des
jonctions communicantes. La technique de FRAP
(Fluorescence Recovery After Photobleaching) est
adaptée pour discriminer précocement les cellules
cancéreuses des cellules saines par létude de la
fonctionnalité de leurs gap junctions. Lobjectif
de la recherche est détudier les réponses de
cellules saines et cancéreuses par application de
cette technique en y associant létude de la
distribution des protéines caractérisant les
jonctions communicantes les connexines (Cx).
Dans lavenir la technique de FRAP pourrait, par
un développement dune instrumentation
spécifique, sappliquer en endoscopie clinique
pour des examens systématiques de dépistage du
cancer. 
Recouvrement à T15 min
Avant photoblanchiment
Après photoblanchiment à T0
MATERIELS ET METHODES Notre étude a été
effectuée sur des cellules de type FaDu
(carcinome de pharynx humain), KB (carcinome oral
humain) et CRL-2703 (fibroblastes humains
naturellement immortalisés). Technique de
FRAP Les cellules sont marquées au 5,6 CFDA
(Molecular probes, Oregon, USA) à 6µg/ml pendant
15min à 37C. Le photoblanchiment est provoqué
par une irradiation laser focalisée sur la
cellule cible à la puissance de 65µW à 488nm
durant 45s, à laide dun microscope confocal
(SP2-AOBS Leica IFR111). Lacquisition du
signal de recouvrement de fluorescence est
effectuée toutes les 15s durant 15min, à une
puissance de 13µW. Immunofluorescence Après
fixation, les cellules sont incubées 45 min avec
un anticorps monoclonal anti-Cx43 de souris ou un
anticorps monoclonal anti-Cx32 de souris(Zymed
laboratories inc, South San Francisco, CA) dilué
au 150, puis incubées 45 min avec un anticorps
secondaire, anti-souris de chèvre, couplé à la
Cy5 (Zymed laboratories inc, South San Francisco,
CA ) dilué au 150. Les cellules immunomarquées
sont analysées au microscope confocal (SP2-AOBS
Leica IFR111).
CRL 2703
KB
FaDu
Figure 4 Mesures de recouvrement de
fluorescence après photoblanchiment sur cellules
de types CRL 2703, KB, FaDu.
la figure 4 reporte des images de recouvrement de
fluorescence important pour les cellules CRL-2703
et KB et faible pour les cellules FaDu. Par
immunofluorescence on observe, à laide des trois
couples dimages figure 5, des distributions
différentes de Cx selon le type cellulaire une
forte concentration de Cx 43 chez les cellules
CRL-2703 et KB et une faible concentration, avec
absence de localisation aux points de contact,
chez les cellules de type FaDu.
RESULTATS Résultats en FRAP
Cx 32
Cx 43
CRL 2703
KB
FaDu
Figure 5 marquage des connexines 32 et 43 des
cellules CRL 2703, KB, FaDu.
CONCLUSION Les résultats obtenus montrent un
recouvrement de fluorescence chez des cellules
saines (CRL-2703) et sur un type de cellules
cancéreuses (KB) pouvant constituer une exception
parmi les cellules cancéreuses analysées. Les
fibroblastes et les KB seront mis en contact avec
un inhibiteur de gap junction pour nous permettre
de valider une absence de recouvrement de
fluorescence due à la non fonctionnalité des
jonctions communicantes. Les études menées sur un
large échantillon de cellules cancéreuses de type
épidermoïde nous permettra de recenser les
cellules ayant la même réponse à la technique de
FRAP que les cellules de type FaDu. La technique
devra ensuite être appliquée sur des cocultures
en contact direct de cellules saines et
cancéreuses puis sur des tissus.
Figures 1,2,3 mesures de recouvrement de
fluorescence après photoblanchiment sur les
cellules CRL-2703, KB, FaDu.