LA PRUEBA DEL ADN

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LA PRUEBA DEL ADN

• El ADN constituye el material genético de las
  células del cuerpo humano.
• Con un tipo de excepción, el ADN se encuentra
  exclusivamente en el núcleo de las células.
• En el genoma humano se estima que hay ? 40,000 ó
  más genes (trozos funcionales del DNA compuestos
  a su vez de 1,000 a 200,000 nucleótidos).
• Los nucleótidos forman un par de cadenas
  apareadas que toman la forma tridimensional de un
  doble hélix. Hay más de 3,000'000,000 de pares
  de bases que constituyen el genoma de una sóla
  célula humana.

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LA PRUEBA DEL ADN

• Cada nucleótido del ADN está compuesto de tres
  subunidades una base nitrogenada, una
  desoxiribosa y un grupo fosfato. Hay cuatro tipo
  de bases nitrogenadas en los nucleótidos del ADN
  timina (T), citosina (C), guanina (G) y adenina
  (A).
• Es importante resaltar que así como hay regiones
  con función conocida o supuesta (los genes),
  sucede que casi la mitad del ADN del genoma
  humano consiste de regiones (intrones) con
  función hasta hoy desconocida y que tienen una
  secuencia de nucleótidos repetitiva en muchos
  casos pero con patrones hipervariables en muchas
  regiones del genoma.

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LA PRUEBA DEL ADN

• Es precisamente de la hipervariabilidad
  (polimorfismo) de estas regiones del ADN de lo
  que se aprovecha para detectar diferencias (o
  semejanzas) entre un ser humano y otro,
  estudiando su ADN.
• Las regiones repetitivas pueden presentarse como
  tandas repetitivas cortas o largas. A esto se le
  llama VNTRs (variable number of tandem repeats)
  entre los que están los STR (short tandem
  repeats), que son las regiones hipervariables
  estudiadas para las pruebas modernas de
  paternidad.

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LA PRUEBA DEL ADN

• Toda célula nucleada contiene 46 cromosomas
  (excepto los gametos los espermatozoides y los
  óvulos, que tiene 23 crmosomas cada uno.
• Los cromosomas son tan sólo la forma como la
  célula ordena su ADN combinándolo con proteínas.
• En el momento de la concepción, se necesita 46
  cromosomas para procrear un nuevo ser humano.
• En consecuencia una persona debe recibir
  exactamente la mitad de su material genético de
  su madre biológica y exactamente la otra mitad
  del padre biológico.

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LA PRUEBA DEL ADN

• Está basada en un análisis exacto de los perfiles
  genéticos de la madre, del niño(a) y del presunto
  padre.
• Si se conocen los perfiles genéticos de la madre
  y de su hijo(a), el perfil genético del padre
  puede ser deducido con certeza casi total.
• Si no se hace la prueba a la madre, los perfiles
  del ADN del niño(a) serán comparados al perfil
  del ADN del presunto padre. La técnica utilizadas
  permiten obtener el mismo grado de exactitud
  (probabilidad de paternidad) en los análisis en
  que no se examina el ADN de la madre sino sólo el
  del hijo(a) y el del presunto padre.

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LA PRUEBA DEL ADN

• El ADN se puede extraer a partir de una variedad
  de muestras
• células epiteliales de la mejilla,
• glóbulos blancos de la sangre
• folículos pilosos
• células fetales (provenientes de líquido
  amniótico) en cultivo
• semen
• otras muestras biológicas(tejidos, etc)

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• Muestras 1-8 Excelentes.
• Muestras 9-15 Buenas o Regulares.
• Muestras 16-20 Regulares o Malas.
• Muestras 21-23 No aceptables.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 1. Hisopos de Muestras de la Mejilla.- Se
  necesita tomar muestras con dos hisopos estériles
  frotando vigorosamente el interior de las
  mejillas (un hisopo por mejilla). La idea es que
  de esta manera unas pocas células epiteliales
  puedan ser desprendidas y transferidas al hisopo.
  Este tipo de muestras permite resultados finales
  en sólo una semana.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 2. Sangre Total.- La sangre total (generalmente
  venosa) funciona muy bien siempre y cuando la
  toma haya sido hecha recientemente y colectada
  apropiadamente en un tubo tipo vacutainer que
  contenga el preservante apropiado.
• La sangre que ha de ser guardada por períodos
  largos debe ser refrigerada. Sólo en estas
  condiciones la muestra de sangre puede servir tan
  bien como una muestra de células de mejilla.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 3. Sangre de Cordón Umbilical.- La sangre del
  cordón umbilical funciona muy bien si llega al
  laboratorio en buenas condiciones. La sangre
  tomada de este modo toma igual de tiempo en
  procesarse que la tomada en tubos vacutainer.
• 4. Manchas de Sangre.- Las manchas de sangre que
  funcionan bien deben haberse tomado en unos
  papeles absorbentes que poseen unas sustancias
  que impiden la acción de enzimas degradantes
  sobre la sangre.
• 5. Semen.- El semen debe llegar al laboratorio
  congelado en tubos apropiados si es de más de 24
  horas. Si es una muestra reciente basta con el
  condón debidamente anudado y guardado en
  refrigeración hasta por 24 horas. Sin embargo,
  procesar el ADN de estas muestras toma un poco
  más de tiempo.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 6. Células Fetales tomadas vía Amniocentesis.-
  Estas células funcionan siempre bien como fuente
  de ADN fetal. Sin embargo, hay que considerar que
  se requiere ponerlas en cultivo durante una
  semana antes de procesarlas. La amniocentesis
  consiste en insertar una aguja fina a través de
  la pared abdominal de la madre gestante hasta
  penetrar dentro del útero. Se toma una muestra
  del líquido en el que flota el feto y es
  precisamente de este líquido que posteriormente
  se colectan algunas células fetales de donde se
  extraerá el ADN. Este procedimiento toma unos 10
  minutos y es realizado por el ginecólogo
  típicamente a partir de las 14 semanas de
  gestación.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 7. Células Fetales del Vello Coriónico.- Estas
  células también requieren ponerse en cultivo
  antes de ser procesadas.
• La muestra de vello coriónico es también un
  procedimiento ginecológico que se realiza
  aspirando una pequeña cantidad de tejido
  placentario primitivo (corion) mediante inserción
  desde la vagina. En este procedimiento se está
  tomando en realidad células placentarias
  exclusivamente pero que, puesto que son de origen
  fetal, corresponden exclusivamente al ADN del
  feto. La ventaja de esta técnica es que puede
  hacerse más temprano en el embarazo - típicamente
  a las 11 semanas.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 8. Tejido Fetal proveniente de Abortos.- El
  tejido fetal es una excelente fuente de ADN
  siempre que no se le haya expuesto previamente a
  la acción del formol (formaldehído al 37). Se
  requiere una semana extra para procesar estas
  muestras.
• 9. Condones o Preservativos de Látex.- El semen
  contenido en condones sirve muy bien como fuente
  de ADN. Es importante que el condón se mantenga
  en refrigeración luego de haber sido usado. Es
  importante notar que del material presente en
  condones usados en relaciones sexuales se puede
  derivar hasta dos tipos de ADN (los ADN de ambos
  miembros de la pareja).

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 10. Manchas de Semen en Ropa.- Se requiere tiempo
  adicional para procesar estas muestras. Se
  sugiere refrigerar el pedazo de ropa lo antes
  posible.
• 11. Tejidos provenientes de Exhumaciones.-
  Muestras exhumadas colectadas de tejido profundo
  del muslo o de médula ósea tomada del fémur
  suelen funcionar un 75 de las veces.
• 12. Cordón Umbilical Seco.- Muestras tomadas del
  cordón umbilical seco funcionan el 50 de las
  veces y toman hasta varias semanas adicionales
  para procesarse.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 13. Cepillos de Dientes.- Los cepillos dentales
  usados funcionan un 50 de las veces. Toman por
  lo menos una a dos semanas más para procesarse.
• 14. Basurilla de Rasuradoras Eléctricas.- La
  basurilla colectada del interior de las
  rasuradoras eléctricas puede ser una buena fuente
  de ADN. Estas muestras toman unas dos semanas
  extras para procesarse.
• 15. Tampones (tampax) o toallas femeninas.-
  Pueden ser una excelente fuente de ADN. Hay que
  refrigerarlas apenas se recojan. Toman dos
  semanas extra para ser procesadas.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 16. Cabello Arrancado.- El cabello debería ser
  halado con suficiente fuerza como para desprender
  la raíz viva de las hebras de cabello. Se
  necesitaría unas 10 a 20 hebras bien tomadas para
  que se pueda obtener suficiente tejido. El
  proceso de estas muestras toma unas cuatro
  semanas.
• 17. Colillas de Cigarrillo.- Las colillas que no
  han estado expuestas al ambiente por mucho tiempo
  suelen funcionar en muchos casos. Requieren
  algunas semanas adicionales de proceso.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 18. Orina.- Esto es para el caso en que se
  requiera examinar orina para hacer una
  comparación entre un individuo y su orina que se
  hubiera usado para dosar drogas ilícitas. La
  orina puede funcionar bien si sucede que contiene
  algunas células epiteliales renales y si la
  muestra se tomó en un recipiente estéril que es
  mantenido refrigerado. Desafortunadamente, cuando
  la orina - tomada para dosaje de drogas - es
  terminada de usar, los laboratorios suelen
  descartarla.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 19. Tejido Incluido en Parafina.- Esta es la
  forma como los patólogos suelen preparar las
  biopsias. Estos bloques de parafina son
  preparados para exámenes de microscopía y no para
  análisis de ADN. Sin embargo, hay familiares de
  personas ya fallecidas que los quieren usar como
  manera post-mortem de determinar paternidad. El
  preservante típicamente usado para fijar las
  biopsias suele ser formol (formaldehído al 37).
  El formol causa entrecruzamientos covalentes
  inter e intramoleculares en el ADN. El formol
  inclusive es capaz de entrecruzar la enzima (que
  usamos para amplificar el ADN) contra el mismo
  ADN que estamos tratando de analizar. En
  consecuencia, es una mala fuente de ADN y se
  logra resultados exitosos en sólo un 25 de los
  casos y tan sólo luego de hasta meses de
  tratativas sin la seguridad de obtener un
  resultado final exitoso.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 20. Papel Higiénico (o kleenex) Usados.- Son
  mala fuente de ADN. Sin embargo, cuando están
  manchados con sangre y son transportados
  correctamente al laboratorio, sí funcionan con
  mucha frecuencia.
• 21. Pelo Caído.- El cabello, vello o pelo
  corporal caído (telogénico) constituye cabello,
  vello o pelo que llegó al final de su ciclo de
  vida y se desprende del cuerpo de manera natural.
  Este tipo de cabello o pelo nunca funciona como
  buena fuente de ADN y se encuentra típicamente
  en peines, cepillos de cabello, ropa, almohadas,
  sábanas, rejillas de desagüe de las duchas.
  Asimismo, el cabello cortado no funciona como
  fuente de ADN.

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Validez de diferentes tipos de Muestra como
fuentes de ADN

• 22. Sangre Seca (podrida).- Las muestras de
  sangre tomadas en tubos no estériles, sin
  preservantes y mantenidas a temperatura ambiente
  por períodos extendidos de tiempo,
  definitivamente no funcionan. Cualquier ADN que
  se pueda extraer de dichas muestras estará tan
  degradado que sencillamente no podremos
  amplificar fragmentos suficientemente grandes
  como para ser analizados.
• 23. Tejidos mantenidos en Formol.- Biopsias o
  tejidos colectados durante autopsias que hayan
  sido puestos en frascos con formol
  definitivamente no funcionan.
• 24. Cenizas Fúnebres.- Los tejidos cremados
  definitivamente no funcionan pues en las cenizas
  fúnebres no hay ADN rescatable .

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LA PRUEBA DEL ADN

• Es la prueba de máxima validez científica para
  determinaciones de parentesco en el mundo.
• La confiabilidad es tan grande como la que le
  merezca a usted el laboratorio al que le confía
  la prueba. Su resultado es contundente.
• Para cada persona examinada se analiza mediante
  la técnica STR (short tandem repeats) un total de
  13 marcadores genéticos (loci de secuencias
  repetitivas tetraméricas) en varios cromosomas
  del ADN que corresponden al llamado CODIS.

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LA PRUEBA DEL ADN

• El CODIS, según las pautas del F.B.I., constituye
  el conjunto de marcadores del ADN que permite
  identificar singularmente a una persona como para
  que sus resultados sean comparables con el banco
  de datos de identificación de individuos de los
  EE.UU.
• Esta combinación especial CODIS hace que el
  perfil genético obtenible para un individuo
  arroje típicamente una probabilidad de repetición
  al azar en otro individuo de 1 en 1015 (ó 1 en
  1,000,000,000,000,000 personas) ..... recordemos
  que en el planeta Tierra hay 5,500,000,000
  humanos vivos y tan solo la cuarta parte de ellos
  son hombres en edad fértil. Es entonces una
  prueba CONTUNDENTE.

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LA PRUEBA DEL ADN

• Técnicamente la prueba puede arrojar un resultado
  negativo (exclusión de paternidad ) con un 100
  de certeza o uno positivo (inclusión de
  paternidad ) con un 99.9999 de certeza.

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LA PRUEBA DEL ADN

• Aquí debemos hacer la precisión de que si no se
  dice 100 sino 99.9999 es por razones meramente
  estadísticas. Hay solo dos casos teóricamente
  posibles en que se podría decir que alguien sí es
  el padre con un 100 de certeza
• a) Luego de haber hecho el análisis a TODOS LOS
  HOMBRES DEL PLANETA y haber descartado a los
  demás.
• b) Luego de haber analizado todos y cada uno de
  los 4,500 millones de nucleótidos de la molécula
  de ADN del padre presunto.
• Naturalmente, ambas proposiciones son en la
  práctica imposibles y un 99.9999999 de certeza
  estadística es entonces perfectamente
  satisfactorio.

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LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de
Paternidad por ADN

• Los STR (short tandem repeats) son loci (lugares
  del ADN) que consisten de elementos secuenciales
  cortos y repetitivos que fluctúan en tamaño (3 a
  7 pares de bases de longitud). Estas tandas
  repetitivas son abundantes y están ampliamente
  distribuídas en el genoma (conjunto total del
  ADN) humano.
• Los STR sucede que son una fuente muy rica de
  marcadores muy polimórficos los cuales pueden ser
  detectados y amplificados mediante la técnica
  conocida como PCR (reacción en cadena de la
  polimerasa).

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LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de
Paternidad por ADN

• Los alelos (tipos) de estos loci se pueden
  diferenciar unos de otros según el número de
  copias de la secuencia repetitiva contenida
  dentro de la región previamente amplificada
  mediante la técnica de PCR.
• Para distinguir uno de otro se separan los
  fragmentos mediante electroforesis (migración en
  un campo eléctrico sobre una superficie de un
  gel) sobre geles de poliacrilamida capaz de
  distinguir los fragmentos en función de sus
  tamaños diferentes. Luego estos fragmentos pueden
  visualizarse usando detección por radiactividad,
  fluorescencia o coloración con sales de plata.

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LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de
Paternidad por ADN

• En este método se usa un método de detección por
  fluorescencia, que es una metodología rápida,
  no-radiactiva que puede usarse para evaluar muy
  pequeñas cantidades de ADN humano (un nanogramo,
  es decir, una milmillonésima de gramo de ADN).
• El análisis mediante el método STR es más
  tolerante que otros métodos cuando se usa
  plantillas de ADN degradadas puesto que los
  productos de la amplificación por PCR miden menos
  de 400 pares de bases en longitud, estas resultan
  ser mucho más pequeñas que las obtenidas mediante
  análisis vía AMP-FLP o VNTR.

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LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de
Paternidad por ADN

• Además de estas ventajas, los loci STR escogidos
  por este método contienen alelos de longitudes
  discretas y separables. Esto permite la
  construcción de escaleras alélicas que contienen
  fragmentos de las mismas longitudes que muchos de
  todos los alelos conocidos para cada locus.
• El método STR tiene un poder de discriminación de
  un hombre entre cada 5,180'000,000 individuos.
• Es importante notar que si la población mundial
  actual es de unos seis mil millones de personas,
  y suponemos que de ellos poco menos de la mitad
  son hombres y que de ellos sólo una fracción es
  una subpoblación masculina en edad fértil, pues
  entonces el poder de discriminación es
  prácticamente absoluto.

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LA PRUEBA DEL ADNMétodo RFLP para la Prueba de
Paternidad por ADN

• Este es un método usado aún por varios
  laboratorios para la determinación de paternidad
  por ADN. Sin embargo, es un método antiguo y - en
  la práctica - es tecnológicamente obsoleto. Hoy
  en día el método más preciso y exacto es el
  Método STR.
• Para efectos de información histórica el método
  RFLP consiste de
• 1) El ADN es extraído de los leucocitos de la
  sangre.

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LA PRUEBA DEL ADNMétodo RFLP para la Prueba de
Paternidad por ADN

• 2) El ADN de la muestra es cirtado en
  fragmentos, los que resultan ser de tamaños
  diversos, precisamente porque estos tamaños
  dependen de la diversidad y variabilidad genética
  de la muestra.
• El nombre RFLP(Restriction Fragment Length
  Polymorphisms) significa que se usa la propiedad
  de las enzimas de restricción para cortar
  regiones específicas del ADN que sucede que son
  muy variables(hipervariables) de individuo a
  individuo(polimorfismo).
• 3) Los fragmentos de ADN son colocados en una
  superfcie gelatinosa(gel de agarosa) con el
  propósito de someterlos a una separación en base
  a su ? tamaño.

31
LA PRUEBA DEL ADNMétodo RFLP para la Prueba de
Paternidad por ADN
4) Se sumerge el gel en una solución conductora y
luego se corre la electroforesis. 5) Puesto que
el gel de agarosa tiene poros, los fragmentos más
pequeños de ADN migrarán hacia el ánodo(polo
positivo) más rápidamente que los fragmentos de
ADN más largos. 6) Los fragmentos de ADN así
separados se transfieren luego por adhesividad a
una membrana de nylon(Southern blott).
32
LA PRUEBA DEL ADNMétodo RFLP para la Prueba de
Paternidad por ADN

• 7) La membrana de nylon contiene ahora covalente
  y firmemente adheridos los fragmentos de ADN en
  la misma posición en que migraron sobre el gel
  durante el proceso de electroforesis.8) Esta
  membrana de nylon es expuesta a sondas marcadas
  de ADN. Estas sondas son pequeños fragmentos
  sintéticos de ADN de secuencia conocida y que
  corresponden a zonas selectas de
  hipervariabilidad del ADN humano. Las sondas
  suelen estar marcadas con isótopos radiactivos o
  con sustancias fluorescentes (por tanto, emisoras
  de luz).

33
LA PRUEBA DEL ADNMétodo RFLP para la Prueba de
Paternidad por ADN

• 9) La membrana de nylon luego se coloca contra
  una película de rayos X (si se usó sondas
  radiactivas) o fotográfica (si se usó sondas
  fluorescentes), la cual luego es revelada.10)
  Las bandas que se observan en la película
  revelada son típicamente así
• Madre Hijo(a) Padre Supuesto 1 Padre Supuesto 2
  

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LA PRUEBA DEL ADNMétodo RFLP para la Prueba de
Paternidad por ADN

• En este ejemplo, el padre supuesto 1 es el
  verdadero padre. A esto se le llama inclusión y a
  esta prueba se le asigna un Índice de Paternidad
  (PI) el cual se cuantifica tomando en cuenta la
  probabilidad (ya conocida por estudios
  horizontales en grupos raciales definidos) de que
  un fragmento (alelo) de tal tamaño aparezca en un
  individuo cualquiera.
• 11) El proceso se repite varias veces usando la
  misma membrana de nylon, pero exponiéndola a
  diversas sondas. Cada sonda identifica áreas
  diferentes del ADN (que mapean en regiones
  diferentes de diferentes cromosomas).12) Los
  diferentes Índices de Paternidad se multiplican
  entre sí (pues estadísticamente se trata de
  eventos que ocurren independientemente) para así
  calcular el llamado Índice de Paternidad
  Combinado (CPI).13) En base al CPI, se aplica
  la siguiente fórmula para calcular la
  Probabilidad de Paternidad (PP)
• PP 1 CPI/(CPI-1)

35
LA PRUEBA DEL ADNExplicación de los Resultados
de Paternidad

• Los resultados se pueden explicar en una de 2
  maneras
• 1. El padre presunto es excluido como padre
  biológico del niño(a).2. El padre presunto no
  puede ser excluido como padre biológico del
  niño(a) y esto se alcanza cuando la probabilidad
  de paternidad es de más de 99.9

36
LA PRUEBA DEL ADNExplicación de los Resultados
de Paternidad

• Los resultados luego detallan los patrones del
  ADN de los individuos a quienes se ha sometido a
  prueba.
• Todos los seres humanos tienen dos marcadores
  genéticos (ó "cifras" para efectos de esta
  explicación), para CADA sistema de ADN analizado.
  Un marcador genético fue heredado de la madre y
  el otro marcador genético obligatoriamente fue
  heredado de su padre biológico.

37
LA PRUEBA DEL ADNExplicación de los Resultados
de Paternidad

• Ejemplo de Exclusión.-
• Sistema Madre Hijo Padre
  Presunto Índice de
  Paternidad
• D9S302 33 33 31 0.00
• 9q31-33 30 32 30
• Puesto que tanto la madre como el hijo ambos
  tienen el marcador genético "33", conocemos que
  el hijo heredó el "33" de su madre. Por tanto,
  obligatoriamente el marcador genético "32" DEBE
  haber sido heredado de su padre
  biológico.Entonces, observando la cuarta columna
  veamos los marcadores genéticos del padre
  presunto Él no tiene un "32" en consecuencia,
  él no puede ser el padre biológico. El índice de
  paternidad para este sistema es 0.00 y, por
  tanto, este sistema lo excluye como el padre
  verdadero.

38
LA PRUEBA DEL ADNExplicación de los Resultados
de Paternidad

• Ejemplo de Inclusión.-
• Sistema Madre Hijo Padre
  Presunto Índice de Paternidad
• D9S302 37 33 35.2 8.37
• 9q31-33 33 30 30
• La madre contribuyó el marcador genético "33" a
  su hijo. Por tanto, obligatoriamente el marcador
  genético "30" DEBE haber sido heredado de su
  padre biológico.
• Entonces, observando la cuarta columna veamos los
  marcadores genéticos del padre presunto Él sí
  tiene un "30" en consecuencia, él ADN en este
  sistema sí cuadra y, por tanto el padre presunto
  PUEDE ser el padre verdadero. El índice de
  paternidad es un indicador de qué tan común es
  este marcador genético en la población (de su
  raza). Mientras más alto es el índice de
  paternidad, más raro es el marcador genético en
  dicha población.

39
LA PRUEBA DEL ADNExplicación de los Resultados
de Paternidad

• Es importante resaltar que para que el padre
  presunto NO sea excluido, TODOS los sistemas de
  ADN probados deben cuadrar. Y se debe probar
  tantos sistemas de ADN como sean necesarios hasta
  obtener una Probabilidad de Paternidad mayor que
  99.9.Considerando que en este caso se trata de
  eventos estadísticos mutuamente excluyentes, los
  índices de paternidad obtenidos para cada sistema
  se deben multiplicar entre sí a esto se le
  llama el CPI (Índice de Paternidad Combinado).

40
LA PRUEBA DEL ADNExplicación de los Resultados
de Paternidad

• Puesto que la Probabilidad de Paternidad es una
  expresión estadística del llamado Índice de
  Paternidad Combinado (CPI), para que la
  probabilidad de paternidad sea diferente que cero
  (y, por tanto, mayor que 99.9), ninguno de los
  números en la columna de Índice de Paternidad
  deberá ser igual a cero.