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Diapositiva 1

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Continuos. Continuos. Consideraciones en los par metros del gradiente ... CONTINUOS. Los gradientes continuos pueden ser hechos a partir de gradientes discontinuos, ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: Diapositiva 1


1
INTRODUCCION
SEDIMENTACION LIBRE
CENTRIFUGACION
ac
ge
g
Fr
Fc
E
R
P
PR
Fc Fuerza centrífuga
?
Ap área proyectada de la partícula en al
dirección perpendicular a su trayectoria CD
coeficiente de arrastre, es función de Rep Vp
volumen de la partícula ?L densidad de la fase
líquida ?p Densidad de la partícula vt
velocidad terminal de partícula
vtc velocidad terminal de partícula en
centrifugación ge gravedad eficaz R radio de
giro, se adopta igual para todas las
partículas ? velocidad angular
CD se evalúa a vtc
2
Fluido en reposo, entonces se adopta para el
modelo que las partículas están quietas y el
fluido se acerca con v vt
Se define al coeficiente de sedimentación
como Usualmente es un número muy pequeño, por
lo que se lo expresa en Svedbers (1 Svedber
10-13 segundos)
Para partículas no esféricas se hace necesario
implementar el diámetro equivalente de partícula.
3
CLASIFICACION
4
CENTRIFUGACION ANALITICA
Aplicable a sustancias puras o mezclas
simples Vr100000 rpm Rotores con cámaras
horizontales y detectores ópticos
IDENTIFICACION POR SU VALOR NEGATIVO PUREZA POR
SU VALOR NEGATIVO ESTIMACION DE COEFICIENTES DE
SEDIMENTACION ESTIMACION DE COMPOSICIONES EN
MEZCLAS DE PARTICULAS
5
CENTRIFUGACION DIFERENCIAL
Es el método más común de separación, y es rara
la purificación enzimática que no lo utiliza. En
este método, el tubo de centrífuga se llena con
una mezcla uniforme problema. Tras la
centrifugación se obtienen dos fracciones un
pellet que contiene el material sedimentado y un
sobrenadante con el material no sedimentado. El
método es bastante inespecífico, y a priori no se
puede saber si la partícula buscada quedará en el
sobrenadante, en el pellet o repartido entre
ambos sin embargo es una técnica muy útil, sobre
todo para aislamiento de células y orgánulos
subcelulares.
6
GRADIENTES DE DENSIDAD
Un gradiente de densidad es un solvente
distribuido con diferentes concentraciones en una
columna en donde la parte inferior es la positiva
por contener el solvente con mayor densidad. El
fluido del gradiente de densidad consiste de un
adecuado soluto de bajo peso molecular en un
solvente en el cual las partículas de la muestra
pueden ser suspendidas.   
Consideraciones en los parámetros del gradiente
7
GRADIENTES DE DENSIDAD LINEALES
La densidad aumenta linealmente con el incremento
en la distancia desde el centro de rotación.
DISCONTINUOS
El método más usado para formar gradientes
discontinuos es comenzar con la solución más
densa y colocarlas en capas de menor densidad
sucesivamente, evitando efectos de mezcla y
oclusión de aire.
Gradiente de densidad discontinuo
Gradiente de densidad discontinuo debido a
efectos difusionales a un cierto t
CONTINUOS
Los gradientes continuos pueden ser hechos a
partir de gradientes discontinuos, de tal manera
que los límites entre las capas comienzan a
desaparecer en la medida que los solutos
difunden, así las discontinuidades comienzan a
linealizarse y en un tiempo suficiente la
densidad se volverá completamente uniforme. Una
forma de hacerlo es rotando cuidadosamente el
tubo de una posición vertical a una horizontal,
bajo estas condiciones un gradiente discontinuo
se convertirá en continuo en menos de 1 hora.
Gradiente de densidad continuo
8
FORMACION DE UN GRADIENTE DE DENSIDAD CONTINUO A
PARTIR DE UNO DISCONTINUO POR DIFUSION
Consideraciones para la formación de gradientes
de densidad
9
GRADIENTES DE DENSIDAD NO LINEALES
No siempre es posible usar un gradiente lineal,
en algunos casos para la resolución particular de
algunas especies sedimentantes puede ser
necesario un perfil más complejo.
Para generar este tipo de gradientes es posible
utilizar cámaras continuas o mezcladores de
gradientes los cuales permiten la formación de
hasta seis gradientes de una sola vez.
10
FORMACION DE GRADIENTES SOLUTOS
Sacarosa. Disacárido ampliamente empleado en la
separación y purificación de materiales
biológicos mediante centrifugación zonal. Sin
embargo presenta una alta viscosidad, lo que no
le permite alcanzar grandes densidades. La
molécula es además osmóticamente activa, por lo
que no es la más adecuada para aislar células o
componentes celulares. Por lo demás es barata y
de fácil adquisición. Otras de sus ventajas es su
carácter no iónico. Se utiliza en el estudio de
proteínas. Ficoll. Polisacárido sintético de
alto peso molecular (400 kDa). Presenta un alto
contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene
una buena solubilidad en medios acuosos. Además
no presenta grupos ionizables que puedan servir
de unión a las muestras. Es estable a pH neutro y
alcalino, pudiendo ser autoclavado sin
degradarse, no altera la presión osmótica del
medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha
utilizado para la separación de células y
partículas subcelulares mediante centrifugación
zonal. Percoll. Suspensión de partículas (5.15
nm) de ácido silícico revestidas de un derivado
de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que
presenta baja viscosidad a densidades altas, no
afecta prácticamente a la presión osmótica del
medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y
10. Es soluble en solución acuosa y estable en
ellas siempre que no haya aniones bivalentes
(sulfato), especialmente a bajos pH. El compuesto
puede ser utilizado para centrifugaciones
zonales, preformando gradientes, o bien para
centrifugación isopícnica, ya que la
centrifugación de percoll en rotores angulares
durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce
un ligero gradiente, independientemente de la
densidad inicial del percoll.
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CENTRIFUGACION ZONAL Y DE EQUILIBRIO
CENTRIFUGACION ZONAL
CENTRIFUGACION DE EQUILIBRIO
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CENTRIFUGAS
MICROFUGAS Velocidad más de 10000 rpm. Tubos
cortos. Sin sistemas auxiliares. Volúmenes muy
pequeños. Útiles en Biología Molecular.
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