KAEDAHKAEDAH DALAM BIOLOGI MOLEKUL

1
KAEDAH-KAEDAH DALAM BIOLOGI MOLEKUL

• PENGEMPARAN- PEMISAHAN MOLEKUL/
  MAKROMOLEKUL/ORGANEL BERDASARKAN SAIZ, BENTUK,
  KELIKATAN , KETUMPATAN
• ELEKTROFORESIS- PEMISAHAN MOLEKUL/ MAKROMOLEKUL
  BERDASARKAN CAS
• MIKROSKOPI- PENGAMATAN MOLEKUL/
  MAKROMOLEKUL/ORGANEL YANG AMAT SENI

2
PENGEMPARAN

• ALAT PENGEMPAR ADALAH ALAT YANG DIGUNAKAN UNTUK
  MEMISAHKAN BAHAN/PARTIKEL DALAM LARUTAN
• KELAS-KELAS
• -PENGEMPARAN ANALITIKAL/ PENYEDIAAN
• -PENGEMPARAN ULTRA DAN KELAJUAN RENDAH
• -PENGEMPARAN PEMBEZA/PENZONAN
• http//ntri.tamuk.edu/centrifuge/centrifugation.ht
  ml

3
PENGEMPARAN ANALITIKAL

• DIGUNAKAN UNTUK MENGUKUR CIRI FIZIKAL PARTIKEL
  YANG DIENAP SEPERTI KOEFISIEN PENGENAPAN DAN
  BERAT MOLEKUL

4
PENGEMPARAN PENYEDIAAN

• MEMISAHKAN PARTIKEL YANG SPESIFIK YANG BOLEH
  DIGUNAKAN SEMULA
• JENIS-JENIS
• -ZON BERKADARAN
• -PEMBEZA
• -PENGEMPARAN ISOPIKNIK

5
PENGEMPARAN ULTRA/KELAJUAN RENDAH

• BERDASARKAN KELAJUAN
• PENGEMPARAN ULTRA- KELAJUAN MELEBIHI 20,000 RPM
• PENGEMPARAN ULTRA KELAJUAN SUPER- KELAJUAN 10,000
  RPM-20,000 RPM
• PENGEMPARAN KELAJUAN RENDAH-KELAJUAN DIBAWAH
  10,000 RPM

6
PENGEMPARAN PEMBEZA

• PARTIKEL-PARTIKEL YANG TERKANDUNG DALAM SAMPEL
  AKAN TERPISAH KE DALAM SUPERNATAN DAN PELET ATAU
  BERADA DALAM KEDUA-DUANYA BERGANTUNG KEPADA SAIZ,
  BENTUK, KETUMPATAN DAN KEADAAN PENGEMPARAN.
• PELET TERKANDUNG DIDALAMNYA CAMPURAN KESEMUA
  KOMPONEN TERENAP DAN BOLEH MENGANDUNGI BAHAN TAK
  TERENAP PADA MULANYA

7
PENGEMPARAN PEMBEZA

• SUPERNATAN MENGANDUNGI BAHAN YANG TIDAK TERENAP
  DAN BOLEH DIENAPKAN DENGAN PENGEMPARAN PADA
  KELAJUAN YANG LEBIH TINGGI

8
PENGEMPARAN PEMBEZA
9
PENGEMPARAN PENZONAN

• SAMPEL DILETAKKAN DIATAS LARUTAN SUKROSA ATAU
  SESIUM KLORIDA
• PARTIKEL AKAN TERPISAH MENGIKUT SAIZ BENTUK
  (ZON BERKADARAN-MASA) ATAU KETUMPATAN (ISOPIKNIK)

10
PENGEMPARAN PENZONAN
11
PENGEMPARAN PENZONAN ISOPIKNIK
12
KOEFISIEN PENGENAPAN

• APABILA KOMPONEN SEL MISALNYA DIEMPAR MELALUI
  LARUTAN BERKECERUNAN, KOMPONEN SEL ITU AKAN
  BERPISAH KEPADA ZON TERSENDIRI ATAU JALURAN
• KADAR BILA MANA KOMPONEN TADI MEMISAH DISEBUT
  SEBAGAI KOEFISIEN PENGENAPAN ATAU NILAI s (UNIT
  SVEDBERG)
• 1 S 1 X 10-13 SAAT

13
NILAI KOEFISIEN PENGENAPAN

• PARTIKEL ATAU KOEFISIEN
• MOLEKUL PENGENAPAN
• LISOSOM 9400S
• VIRUS MOSAIK TEMBAKAU 198S
• RIBOSOM 80S
• MOLEKUL RNA RIBOSOM 28S
• MOLEKUL tRNA 4S
• MOLEKUL HEMOGLOBIN 4.5S

14
KELAJUAN PENGEMPARAN

• PARTIKEL YANG BERPUSING MEMPUNYAI DAYA TARIKAN
  YANG BERUPA MAGNITUD KEPADA FUNGSI HALAJU PADA
  SUDUT TERTENTU (KELAJUAN PUSINGAN) DAN RADIUS
  PENGEMPARAN (JARAK ANTARA BEKAS SAMPEL DENGAN
  PUSAT ROTOR
• TERDAPAT 2 CARA UNTUK MEMPERIHALKAN DAYA TARIKAN
  INI
• a)KUASA PENGEMPARAN RELATIF
• b) PUTARAN SEMINIT (rpm)

15
KUASA PENGEMPARAN RELATIF

• DAYA TARIKAN PENGEMPARAN BERDASARKAN ATAU RELATIF
  KEPADA TARIKAN GRAVITI PIAWAI
• CONTOHNYA 500x g BERMAKSUD DAYA TARIKAN YANG 500
  KALI LEBIH BESAR DARIPADA DAYA TARIKAN GRAVITI
  PIAWAI

16
KUASA PENGEMPARAN RELATIF

• PERSAMAAN
• R.C.F. 1.119 x 10 -5 (rpm2) r rpmpusingan
  seminit
• rradius (dalam cm)
• UNIT g

17
ELEKTROFORESIS

• PERGERAKAN PARTIKEL BERCAS YANG DIPENGARUHI OLEH
  ALIRAN ELEKTRIK
• ELEKTROFORESIS ADALAH KAEDAH UNTUK MEMISAHKAN
  MAKROMOLEKUL SEPERTI ASID NUKLEIK DAN PROTEIN
  BERDASARKAN SAIZ, CAS ELEKTRIK DAN CIRI FIZIKAL
  SEPERTI KETUMPATAN DAN LAIN-LAIN
• PEMISAHAN DIBANTU OLEH MATRIKS SEPERTI
  POLIAKRILAMID ATAU
• AGAROS

18
ELEKTROFORESIS

• PRINSIP PEMISAHAN MAKROMOLEKUL BERGANTUNG KEPADA
  DUA CIRI IAITU BERAT DAN CAS
• ALIRAN ELEKTRIK DARI ELEKTROD AKAN MENOLAK
  MOLEKUL MANAKALA ELEKTROD YANG LAGI SATU AKAN
  MENARIKNYA PADA MASA YANG SAMA
• MOLEKUL AKAN BERGERAK ANTARA LIANG YANG TERBINA
  ANTARA JALINAN MATRIKS YANG BERTINDAK SEBAGAI
  PENAPIS YANG AKAN MEMISAHKAN MOLEKUL BERDASARKAN
  SAIZ

19
ELEKTROFORESIS

• ALIRAN ELEKTRIK AKAN MEMAKSA MAKROMOLEKUL MELALUI
  LIANG
• PERGERAKAN MAKROMOLEKUL BERGANTUNG KEPADA
  KEKUATAN MEDAN ELEKTRIK, SAIZ DAN BENTUK MOLEKUL,
  SIFAT HIDROFOBIK RELATIF SAMPEL DAN KEKUATAN
  IONIK SERTA SUHU PENIMBAL ELEKTROFORESIS
• PEWARNAAN AKAN MEMBOLEHKAN MAKROMOLEKUL KELIHATAN
  DALAM BENTUK SIRI JALURAN YANG TERPISAH

20
ELEKTROFORESIS PROTEIN

• PROTEIN MEMPUNYAI CAS BERSIH POSITIF ATAU NEGATIF
  HASIL GABUNGAN ASID AMINO-AMINO BERCAS YANG
  TERKANDUNG DIDALAMNYA
• MATRIKS YANG SERING DIGUNAKAN UNTUK MEMISAHKAN
  PROTEIN ADALAH POLIAKRILAMID
• ELEKTROFORESIS GEL DUA DIMENSI-PEMISAHAN PROTEIN
  BERDASARKAN TITIK ISOELEKTRIK DAN BERAT MOLEKUL

21
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D

• PEMFOKUSAN ISOELEKTRIK-
• -LANGKAH PERTAMA PEMISAHAN PROTEIN BERDASARKAN
  TITIK ISOELEKTRIK (PROTEIN MENGANDUNGI BERBAGAI
  NISBAH CAS POSITIF DAN NEGATIF)
• -MELALUI GEL BERBENTUK TIUB ELEKTROFORESIS,
  PROTEIN AKAN BERGERAK DALAM LARUTAN YANG
  MEMPUNYAI KECERUNAN PH -

22
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D

• PEMFOKUSAN ISOELEKTRIK-
• -PROTEIN AKAN TERHENTI BILA IA TIBA DI NILAI pH
  YANG SAMA DENGAN TITIK ISOELEKTRIKNYA IAITU
  APABILA PROTEIN ITU TIDAK MEMPUNYAI CAS BERSIH

23
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D

• ELEKTROFORESIS GEL DUA DIMENSI- -LANGKAH KEDUA
  ADALAH MEMBUAT LARIAN ELEKTROFORESIS DALAM ARAH
  ORTHOGON DARI LANGKAH PERTAMA DAN SDS DITAMBAHKAN

24
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D
25
ELEKTROFORESIS PROTEIN 1-D

• PEMISAHAN PROTEIN SATU DIMENSI PEMISAHAN PROTEIN
  BERDASARKAN BERAT MOLEKUL
• TEKNIK INI DIPANGGIL ELEKTROFORESIS GEL
  POLIAKRILAMID-SDS (PAGE) ATAU SDS-PAGE KERANA
  KEHADIRAN SDS DALAM PENYEDIAAN SAMPEL
• SIMULASI ELEKTROFORESIS 1-DIMENSI
• http//www.rit.edu/pac8612/electro/
• Electro_Sim.html

26
SDS-PAGE

• PEMISAHAN PROTEIN BERSAIZ 5 - 2,000 kDa
• LIANG ANTARA POLIAKRILAMID DIUBAH ANTARA 3-30
• SAMPEL PROTEIN YANG DIKAJI ADALAH DALAM BENTUK
  STRUKTUR PRIMER PROTEIN (PENDIDIHAN BERSAMA
  DENGAN SDS DAN ?-MERKAPTOETANOL)
• PEWARNAAN PROTEIN DENGAN PEWARNA BIRU COOMASIE
  ATAU PERAK
• PEWARNAAN TAK LANGSUNG ANTIBODI TERIKAT
  RADIOISOTOP, ENZIM ATAU PEWARNA FLUORESENS

27
SDS-PAGE

• FUNGSI SDS DETERGEN BERCAS NEGATIF YANG
  BERGABUNG DENGAN KAWASAN HIDROFOBIK MOLEKUL
  PROTEIN DAN MENGAKIBATKANNYA TERBUKA MENJADI
• RANTAI POLIPEPTIDA
• YANG PANJANG DAN TERBEBAS DARI IKATAN DENGAN
  LAIN-LAIN PROTEIN DAN LIPID

28
SDS-PAGE

• FUNGSI ?-MERKAPTOETANOL MEMECAHKAN IKATAN
  DISULFIDA BAGI MEMBOLEHKAN SUBUNIT PROTEIN
  DIANALISA

29
ELEKTROFORESIS ASID NUKLEIK

• MATRIKS YANG SERING DIGUNAKAN UNTUK MEMISAHKAN
  ASID NUKLEIK ADALAH AGAROS ATAU POLIAKRILAMID
• TEKNIK INI DIPANGGIL ELEKTROFORESIS GEL AGAROS
• SAMPEL MENGANDUNGI DNA AKAN DIMASUKKAN KE DALAM
  TELAGA YANG LETAKNYA BERDEKATAN DENGAN ELEKTROD
  BERCAS NEGATIF
• DNA YANG BERCAS NEGATIF AKAN DITARIK KE ARAH
  ELEKTROD POSITIF

30
ELEKTROFORESIS ASID NUKLEIK

• DNA YANG BERSAIZ BESAR AKAN BERGERAK LAMBAT
  MANAKALA YANG BERSAIZ KECIL AKAN BERGERAK CEPAT
• PEWARNAAN DENGAN ETIDIUM BROMIDA AKAN MEMBOLEHKAN
  KITA MELIHAT ASID NUKLEIK KERANA BERLAKUNYA
  SELITAN ETIDIUM BROMIDA DIANTARA BES-BES PADA
  ASID NUKLEIK
• ETIDIUM BROMIDA AKAN BERWARNA OREN APABILA
  DISINARKAN DENGAN LAMPU ULTRA-LEMBAYUNG

31
ELEKTROFORESIS ASID NUKLEIK
32
MIKROSKOPI

• KAEDAH AWAL DALAM MENGKAJI BIOLOGI SEL
• PRINSIP MEMBESARKAN IMEJ YANG KECIL
• JENIS-JENIS MENGIKUT SAIZ PEMBESARAN IMEJ
• -MIKROSKOP CAHAYA (300nm-2mm)
• -MIKROSKOP ELEKTRON (0.15nm-100?m)

33
MIKROSKOP CAHAYA

• PRINSIP PEMBESARAN IMEJ
• CAHAYA DARI BAWAH MIKROSKOP MELALUI KONDENSER
  YANG AKAN MENUMPUKAN CAHAYA KE ARAH SPESIMEN.
  CAHAYA YANG MELALUI SPESIMEN AKAN DIKUMPULKAN
  SEMULA OLEH KANTA OBJEKTIF
• YANG AKAN MENGHASILKAN IMEJ

34
MIKROSKOP CAHAYA

• JENIS-JENIS
• MIKROSKOP MEDAN TERANG
• MIKROSKOP MEDAN GELAP
• MIKROSKOP KONTRA-FASA
• MIKROSKOP GANGGUAN-PEMBEZA
• MIKROSKOP PENDARFLUOR (UV)
• (FLUORESIN/RHODAMIN)

35
MIKROSKOP ELEKTRON

• PRINSIP
• -PENGGUNAAN ELEKTRON DAN BUKANNYA CAHAYA UNTUK
  MEMBESARKANNYA IMEJ.
• -SPESIMEN PERLU MENJALANI PROSES PERSEDIAAN
  SEPERTI DILAPISKAN DENGAN SALUTAN EMAS NIPIS BAGI
  MEMBOLEHKAN ELEKTRON TERPANTUL SEMULA SEBELUM
  IMEJ DITUMPUKAN KE SKRIN

36
MIKROSKOP ELEKTRON

• JENIS-JENIS
• 1) MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI
• ELEKTRON AKAN MELALUI SPESIMEN DAN IMEJ
  DITUMPUKAN PADA SKRIN FLUORESENS
• -STRUKTUR DALAMAN SPESIMEN DAPAT DILIHAT

37
MIKROSKOP ELEKTRON

• JENIS-JENIS
• 2) MIKROSKOP ELEKTRON PENGIMBAS
• ELEKTRON AKAN DITUMPUKAN KEPADA SPESIMEN YANG
  KEMUDIANNYA AKAN TERPANCAR SEMULA (DIIMBAS) KE
  BAHAGIAN PENGESAN DAN IMEJ DIHANTAR KE SKRIN
  UNTUK DILIHAT
• -STRUKTUR LUARAN SPESIMEN DAPAT DILIHAT

38
MIKROSKOP ELEKTRON
ALAT ELEKTRON MIKROSKOP PENGIMBAS
IMEJ NYAMUK MENGGUNAKAN MIKROSKOPI ELEKTRON
PENGIMBAS
39
KAEDAH-KAEDAH LAIN

• KROMATOGRAFI
• -KERTAS PEMISAHAN PROTEIN MENGGUNAKAN KERTAS
  TURAS
• -PERTUKARAN-ION (ION EXCHANGE)
• -TURASAN GEL (GEL FILTRATION)
• -KEAFINAN (AFFINITY)
• -CECAIR BERTEKANAN TINGGI (HPLC)

40
KAEDAH-KAEDAH LAIN

• PENGGUNAAN RADIOISOTOP UNTUK MENANDA MOLEKUL
  32P, 131I, 35S, 14C, 45Ca, 3H
• - RIA, EKSPERIMEN PULSE-CHASE, AUTORADIOGRAFI
• PENGGUNAAN ANTIBODI (MONOKLON/POLIKLON) UNTUK
  MENANDA MOLEKULEIA, IF, ELISA
• ANALISA DIFRAKSI X-RAY PENENTUAN STRUKTUR
  PROTEIN
• TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN